兩株酒曲毛霉的分離及BIOLOG微生物系統分析鑒定

廖永紅,任文雅,伍松陵,沈 晗

(1.北京工商大學化學與環境工程學院,北京 100048; 2.國家糧食局科學研究院,北京 100037)

兩株酒曲毛霉的分離及BIOLOG微生物系統分析鑒定

廖永紅1,任文雅1,伍松陵2,沈 晗1

(1.北京工商大學化學與環境工程學院,北京 100048; 2.國家糧食局科學研究院,北京 100037)

利用稀釋平板法從曲樣和酵泥單菌落中分離獲得 2株毛霉 1#和 2#,通過對其形態觀察和Biolog微生物系統鑒定,確定 2株菌分別為:1#菌為卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌為密叢毛霉 (M ucor plumbeus Bonord)。所得菌株進行冷凍干燥保藏。不同菌種對Biolog 96孔碳源利用有顯著差異,同一菌種不同時間對 Biolog 96孔碳源利用也有差異,分析得出 1#、2#毛霉主要利用 ɑ-酮戊二酸、L-谷氨酸。

毛霉,分離,Biolog微生物系統鑒定

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種分離用培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基、察氏培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基[6-7]; Biolog鑒定用麥芽汁培養基 2%麥芽汁,2%瓊脂,冷卻后調整 pH至 5.5 ±0.2(28℃),121℃滅菌15min;曲粉,接種液。

濁度計、FF接種板、Biolog微生物儀 美國Biolog公司;130s型超凈工作臺 北京賽博伯樂實驗技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛霉的分離與純化 毛霉的分離純化過程工藝流程如下:

無菌條件下,將曲搗碎,稱取適量樣品,選取適宜的稀釋度用生理鹽水稀釋,以涂布平板法分別涂于馬鈴薯葡萄糖培養基、察氏培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基平板上,35℃培養 48h,檢查菌落出現情況。取單菌落,用接種針挖掘一小塊菌絲移植于另一平板培養基上,35℃培養 72h,再從長有單菌落的平板中選取典型的毛霉菌落,取孢子體制成懸液,涂布培養、鏡檢,重復培養 2～3次以分離純化毛霉。將純化了的毛霉轉接到察氏斜面上培養,待生長完好后置于 4℃冰箱中保存。

1.2.2 Biolog微生物鑒定 按照 Biolog微生物自動分析系統的標準[8],對從樣品中分離出的 1#、2#菌種作微生物鑒定,分析菌種利用 C源的情況。

1.2.2.1 樣品菌種活化 將察氏培養基冷卻后倒入小平板中(大約 10mL)。放置到 28℃的培養箱中培養 48h,以確定平板沒有被污染。然后采取點植法將菌種點到察氏培養基進行活化培養。

挑取斜面上的菌,采用點植法,進行培養,時間是 48h,溫度是 28℃。

1.2.2.2 鑒定方法[9]濁度調整:關閉電源,調整指針至“0”刻度;用吸水紙擦干凈空白接種液管外壁,置于濁度計中,接通電源,用無菌水調整指針至100%T。菌懸液制備:取無菌棉簽在接種液中蘸濕,將棉簽在菌落表面轉動,粘取菌體,注意不要帶出培養基。傾斜接種液管并沿內壁轉動棉簽,使菌體附著在內壁上,同時將菌體均勻打散。通過添加菌體或空白接種液調整濁度值,使其在相應標準濁度值的 ±2%范圍內。由于標準管中不是水,所以調整濁度的時候要十分小心。使用濁度標準管調整至標準濁度值 75%±2%。接種微平板:將已經調整好濁度的菌液,用 100μL的移液槍仔細地接種到 Biolog鑒定板上,放置在裝離心管的長盒中,并在盒的底部鋪上手紙,保持一定的濕度。微平板讀數:FF微平板讀數時間分別為:0h,微平板培養后 24、48、72、96、120、144、168h。Biolog Microstation系統會自動檢索并讀取數據,同時給出最匹配的 10個 ID名稱。

1.2.3 菌種保藏 對所得菌種采用真空冷凍干燥法保藏[10]。將裝有菌懸液的安碚管直接放在低溫冰箱中(-80℃)或放在干冰無水乙醇浴中進行預凍。然后置于真空干燥箱中,開動真空泵進行真空干燥,最后將安碚管封口置于冰箱 (5℃左右)中或室溫下避光保存。干燥后樣品呈白色疏松狀態。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離與純化

樣品稀釋后在馬鈴薯葡萄糖培養基、察氏培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基上培養,發現土豆培養基上主要是有酵母菌和霉菌,其中霉菌主要是毛霉、根霉、曲霉[11];麥芽汁培養基上有較多的酵母菌生長;在察氏培養基上主要是霉菌;從 4種培養基平板中共分離出霉菌 6株,對其中兩株毛霉進行研究,依次編號為 1#、2#。

2.2 菌種的形態特征

毛霉繁殖迅速,菌落質地疏松,菌絲體呈雪白色,細密,絨毛狀,無假根和匍匐枝,孢子囊梗直接由菌絲體生出,孢子圓形、淺褐色。

2.3 B io log微生物自動分析系統鑒定菌種

Biolog軟件將讀取的 96孔微平板反應結果按照與數據庫的匹配程度列出 10個結果,每個結果均顯示 3種重要的參數,即可知 Probability(PROB),相似性 S imilarity(S IM)和位距 Distance(D IS)。S IM和D IS是最重要的 2個參數,S IM值表示測試結果與數據庫相應數據條的相似程度,D IS值表示測試結果與數據庫相應數據條的位距。Biolog系統規定:絲狀真菌培養 24h時 S IM值≥0.9、培養 48h時 S IM值≥0.70、培養 76h時 S IM值≥0.65、培養 96h時 S IM值≥0.60時,系統會自動給出較為可靠的鑒定結果, S IM值越接近 1.00,鑒定結果的可靠性越高。

鑒定結果:按Biolog微生物鑒定標準方法對 1#、2#菌進行菌種鑒定,結果見表 1。

表 1 Biolog微生物自動分析系統鑒定結果

碳源分析:結果顯示 1#、2#屬于毛霉,同分離純化結果相同?？疾旄髦昃?0～168h對 FF板上 C源的利用,其結果見圖 1和圖 2(圖 1和圖 2中的字母序號代表 FF版上不同碳源的位置)。

圖 1 1#菌種 C源利用情況

圖 2 2#菌種 C源利用情況

結果分析:在所有碳源中,選擇菌種利用最高的10種進行分析。兩株菌雖然對α-酮戊二酸、D-木糖的利用率較高,但最高峰的數值卻不同。1#菌和 2#菌都可以利用α-酮戊二酸,且都在 48h時達到最大值,但 1#菌為 810,2#菌為 650。

1#菌對α-酮戊二酸、D-木糖的利用率最高,其它碳源的利用在 48h左右達到最高,此后一段時間基本保持穩定。但在 120h時L-天門冬氨酸成為了利用最高的碳源。2#菌雖然對 L-丙氨酸、D-木糖的利用率很高,但其它碳源的利用也隨著時間呈現上升趨勢,利用比較平均。

168h時,1#菌種和 2#菌種利用 L-丙氨酸、D-木糖、α-酮戊二酸為主要碳源。但 1#菌種對甘氨酰-L -谷氨酸、赤藻糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷利用率高于 2#菌種,而 2#菌種對N-乙酰-D-半乳糖胺的利用率高于 1#菌種。

天然 D-木糖是以多糖的形態存在于植物中。因為它們特別在農產品的廢棄部分中 (例如玉米的穗軸、秸稈、棉桃的外皮)含量很多,所以用在生產上是經濟廉價的原料。

由此得出,菌種對碳源的利用隨著生長時間的變化而改變。各個菌種所利用的碳源種類不同,在同一時間下對相同碳源的利用率也有差別,菌種的來源以及不同生長階段都會影響對碳源的利用。

3 結論

利用平板分離法從曲粉中分離出 2種菌,Biolog鑒定結果分別為:1#菌卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌密叢毛霉 (M ucor plum beus B onord)。

分析 1#、2#菌對 Biolog96孔碳源利用情況,得出菌種對碳源的利用隨著生長時間的變化而改變。各個菌種所利用的主要碳源雖然相同,但是對其他碳源的利用還是存在差異。例如 1#菌種還可以利用赤藻糖醇,2#菌種可以利用N-乙酰-D-半乳糖胺,同一時間下菌種對相同碳源的利用率不同,菌種的來源以及不同生長階段都會影響對碳源的利用。

后續工作中需進一步研究混合菌種的發酵特性、產香分析及感官評價,為曲中優勢微生物菌群的構建以及進一步優化蛋白酶提供實驗依據。

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Samples of the two types of bacteria isolated and the biolog m icroorgan ism identification system

L I AO Yong-hong1,RENW en-ya1,W U Song-ling2,SHEN Han1
(1.College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China; 2.Academy of Science Research of State Administration of Grain,Beijing 100037,China)

M ucor we re isola ted by s treak p la te m e thod,two M ucor s tra ins we re ob ta ined nam ed1#and2#, resp ec tive ly.B iolog autom a ted m ic robes identifica tion sys tem(B iolog Sys tem)was used to check twoM ucor s tra ins 1#and2#,which we re sep a ra ted and p urified from fe rm ented g ra ins of Chinese liquor.1#was identified as M ucor c irc ine lloides v.Tiegh and2#was identified as M ucor p lum beus Bonord.The results ind ica ted tha t B iolog Sys tem could be used to identify m ucor s tra ins in fe rm ented g ra ins.The las t,the s tra in through c ream e ry exp e r im ent was conse rved.D iffe rent s tra ins had d iffe rent result,1#,2#M ucorm a in useɑ-ke tog luta ric ac id,L-g lutam ic ac id.

M ucor;isola tion;B iolog m ic rob ia l identifica tion sys tem

TS201.3

A

1002-0306(2010)01-0191-03

酒曲中有豐富的微生物[1],釀造酒的獨特風味及其質量與酒曲中的微生物密切相關。民間傳統酒曲中主要分離得到的微生物有酵母菌、霉菌和細菌。其中霉菌中的毛霉具有較強的蛋白酶活性[2-3],采用不同的毛霉制曲,產物的風味和營養也不同,因此對酒曲中的霉菌進行種屬鑒定對酒的生產和發酵工藝的改良有重要的指導意義。Biolog微生物自動分析系統是美國Biolog公司從 1989年開始推出的一套微生物鑒定系統[4-5],可以鑒定包括細菌、酵母、絲狀真菌在內的近 2000種微生物。Biolog微生物自動鑒定系統能利用計算機進行數據分析,自動化和標準化程度高,鑒定范圍大、速度快,目前已成為微生物分類鑒定常用的技術手段。本實驗將酒曲中的毛霉進行分離培養,然后利用 Biolog微生物自動鑒定系統對分離得到的菌株進行分類學鑒定,初步探討Biolog鑒定系統在酒曲毛霉菌鑒定中的應用,為曲中的微生物分析奠定了基礎。

2009-06-30

廖永紅 (1965-),女,副教授,主要從事有關發酵工程及應用微生物技術方面的教學和科研工作。

科技部工業微生物菌種資源標準化整理、整合及共享試點項目(2005DKA21204-07)。