高產酸性能乳酸菌的篩選及產酸機理研究

馬春麗,張蘭威

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱工業大學食品與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090)

高產酸性能乳酸菌的篩選及產酸機理研究

馬春麗1,張蘭威2

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱工業大學食品與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090)

為選擇產酸性能優良的乳酸菌用于酸奶生產,本實驗對生產酸奶常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的產酸能力進行了研究,測定了其發酵過程中滴定酸度和 pH的變化,并對其產酸機理進行了初探。研究結果表明,乳酸菌各菌株的產酸能力各不相同,菌株 T M111-S產酸速度較快,pH下降速度較快,發酵凝乳最終 pH較低。乳酸菌產酸能力與菌體細胞內β-半乳糖苷酶的量相關。篩選性能優良乳酸菌菌株對生產高質量的酸奶,提高工業化生產效率具有一定的意義。

酸奶,乳酸菌,酸度,β-半乳糖苷酶

在酸奶生產中使用的發酵劑菌種的性能直接關系到酸奶質量的好壞,篩選性能優良的菌株,對生產高質量的酸奶意義重大。產酸力是乳酸菌的重要特性,快速產酸的乳酸菌在發酵過程中可以縮短發酵時間,提高生產效率。本實驗以生產酸奶的兩種常用乳酸菌——保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的多個菌株為實驗菌株,篩選其首要特性產酸能力強的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

菌株代號 T M111-S、G-3、3#、7#、9#、1.1#,東北農業大學食品學院貯藏;脫脂乳粉、鄰-硝基酚(ONP) 購自中國醫藥集團上海化學試劑公司;鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 購自 Sigma公司;其它試劑 均為國產分析純。

751-紫外可見分光光度計,冷凍離心機(Beckman),pHS-25型酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌株發酵性能測定 以 3%接種量將菌種接入 12%的滅菌脫脂乳中進行酸奶制作,每隔 1h取樣測定酸度,同時測定 pH,以時間為橫坐標,分別以酸度和 pH為縱坐標繪圖,觀察酸度變化。記錄各菌株所制作酸奶的凝乳時間,測定凝乳時的酸度和pH,觀察其組織狀態,比較各菌株的發酵性能。

1.2.2 發酵酸度檢測方法 發酵乳的酸度采用吉爾涅爾度(°T)表示;pH測定采用 PHS-25型酸度計直接測定。

1.2.3 發酵過程菌體乳糖酶的提取及活力測定

1.2.3.1 發酵過程菌體乳糖酶的提取 酸奶樣品充分混合后取適量樣品,每克酸奶樣品溶于 20mg 1% EDTA(pH12,4℃)溶液中,離心 (4℃,5400×g, 10min),去除上清液,將菌體細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次。將菌體細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中,配成菌體濃度為 100mg/mL的懸液,采用 5%氯仿, 45℃保溫 8～12h對菌體進行破壁,離心 (4℃,10000 ×g,10min),得無細胞酶提取液,待測酶活 (楊貞耐, 1989;J.P.Burton,1997)。

1.2.3.2 ONP標準曲線的繪制 濃度梯度為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μmol ONP/mL,按下面方法制備:準確稱取 139mg ONP于 1000mL容量瓶中,用 10mL 95%的乙醇溶解,用水稀釋定容,混勻。用移液管分別取 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mL上述配制溶液,分別加到 100mL容量瓶中,每個容量瓶中加入 25mL NaCO3溶液 (50g NaCO3和 37.2g EDTA于 1000mL容量瓶中,少量水溶解稀釋),用磷酸鹽緩沖液稀釋,混勻。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。在分析過程中，多組間的數據比較處理采用One-way ANOVA方法進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

以水作空白,用 10mm比色杯在 420nm下測定每個ONP標準溶液的吸光值,以 ONP濃度為橫坐標,吸光值(OD)為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.3.3 樣品中乳糖酶活力的測定 采用 ONPG為酶作用底物,生成有色產物 ONP,通過比色法來測定,重復 3次取平均值。在此條件下,每分鐘從培養基臨-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG)中釋放出 1.30mmol臨-硝基苯酚(ONP)所需的酶量定義為一個酶活單位(NLU)(C.G.Vinderola,2003)。

1.2.3.4 發酵液中β-半乳糖苷酶活力的測定 將活化后的菌種按 1%接種量接種于液體培養基中,37℃恒溫培養一定時間,將發酵液離心 (5400×g, 15min),傾去上清液,取沉淀,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,收集菌體,將其配成濃度為 100mg菌體/mL緩沖液的懸液,破壁,離心 (4℃,10000×g,10min),得無細胞酶提取液,待測酶活。

2 結果與分析

2.1 實驗菌株的發酵產酸性能

將 6株乳酸菌菌株制備發酵劑,進行脫脂乳發酵實驗,觀察酸度變化(圖 1)。

圖 1 乳酸菌菌株發酵過程產酸曲線

由結果可以看出,不同菌株發酵產酸性能有差異,各菌株發酵酸度均隨發酵時間的延長逐漸增大, pH逐漸降低。菌株 T M111-S、G-3發酵脫脂乳產酸性能較佳,pH下降較快。

在相同培養條件下利用各菌株制備發酵乳凝乳時酸度、pH和凝乳時間見表 1,結果顯示,6株菌產酸能力順序為 T M111-S、G-3、3、9、7、1.1,菌株T M111-S凝乳時間最短,產酸能力最高,凝乳時 pH最低,達到 4.78,因此選擇快速產酸菌株直接關系到酸奶生產所需時間。

表 1 各菌株的發酵性能

2.2.1 ONP標準曲線的測定 ONP標準曲線的測定結果見圖 2。該標準曲線的回歸方程為 Y=4.3179X +0.0096,相關系數 R2=0.9991,其中 Y:420nm處的吸光度;X:鄰硝基苯酚的濃度(μmol/mL)。

圖2 ONP標準曲線

2.2.2 β-半乳糖苷酶在酸奶發酵過程中的活力變化

在脫脂乳發酵過程中對 T M111-S發酵劑菌體產生的糖代謝酶:β-半乳糖苷酶的活力進行測定,結果見表2。

表 2 β-半乳糖苷酶在酸奶發酵過程中的變化(ˉX±SD,n=3)

隨發酵時間的延長,β-半乳糖苷酶活性逐漸增強,酸度逐漸升高。乳糖經乳酸菌的作用一部分轉變成乳酸,是通過乳酸菌的β-半乳糖苷酶作用,將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖,之后單糖被分解代謝產生乳酸。有研究表明,將乳糖經β-半乳糖苷酶分解代謝為葡萄糖和半乳糖的步驟為乳糖代謝的限速步驟。從結果可以看到,在酸奶制品發酵過程中,菌體細胞在此過程中始終產生β-半乳糖苷酶,并隨發酵時間的延長,其活力逐漸上升。與此相對應,產生的乳酸量逐漸增加,pH逐漸降低。當β-半乳糖苷酶催化下產生的乳酸不足以抑制其活性時,它就會繼續分解乳糖產生乳酸 (郭清泉,2002),使發酵乳的酸度繼續升高。可見,乳酸的產生和β-半乳糖苷酶的活性呈正相關。

2.3 菌株在發酵液中酶活力的比較

經液體培養發酵一定時間后得菌體,進行酶活力的測定,測定菌株的酶活曲線如表 3所示。

表 3 菌株在發酵液中乳糖酶活力變化(ˉX±SD,n=3)

菌株酶活力隨培養時間的延長逐漸增大,但在發酵后期酶活力趨于平穩,可能是乳糖經β-半乳糖苷酶的分解所產生的乳酸,反過來又抑制β-半乳糖苷酶的活性。結果顯示,T M111-S和 G-3產酶能力較強,這與它們產酸能力相對應。

3 結論

乳酸菌菌株間產酸能力存在差異,通過實驗比較,T M111-S菌株產酸能力較強,乳酸菌產酸能力與發酵過程中產生的β-半乳糖苷酶的量具有相關性,本研究為高產酸菌株的篩選奠定了理論基礎。

[1]陳鐵濤 .克魯維酵母培養特性及透性化細胞乳糖酶的研制與應用[D].東北農業大學碩士學位論文,1998.

[2]楊貞耐,駱承庠 .乳糖酶提取與純化的研究[J].中國乳品工業,1989,17(4):147-152.

[3]J P Burton.Properties of porcine and yogurt lactobacilli in relation to lactose intolerance[J].J Dairy Sci,1997,80:2318 -2324.

[4]郭清泉 .普通酸奶制品在貯存過程中發酵劑菌的β-半乳糖苷酶活性測定及變化規律研究 [J].食品工業科技,2002 (3):34-36.

[5]王璋 .食品化學[M].北京 .中國輕工業出版社,1999.

[6]C G Vinderola,J A Reinheimer.Lactic acid starter and probiotic bacteria:a comparative“in vitro”study of probiotic characteristics and biological barrier resistance[J].Food Research International,2003,36:895-904.

Study on screen ing of high acid-produing stra ins and mechan ism of acid-produing

MA Chun-li1,ZHANG Lan-wei2
(1.College of Food Science,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China; 2.College of Food Science and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

Lac tic ac id bac te ria(LAB)s tra ins we re se lec ted from S trep tococcus the rm op hilus(S.t)and Lac tobac illus bulga ricus(L.b)which we re w ide ly used in the p rep a ra tion of yogurt,and the ir ac id-p roduc ing cap ab ility was s tud ied in orde r to sc reen out high ac id-p roduc ing bac te ria from LAB.The changes in titrab le ac id ity and pH of s ix LAB s tra ins we re de tec ted during fe rm enta tion.The m echanism of ac id-p roduing about LAB was d iscussed.The results ind ica ted the ac id-p roduing cap ab ility was d iffe rent am ong s ix LAB s tra ins,and the T M111-S s tra in showed quicke r ra te of ac id-p roduing,s lowe r ra te of dec lining in pH and lowe r pH a t the end of coagula tion.The ac id-p roduing cap ab ility of LAB was re la ted w ith the content ofβ-ga lac tos idase in bac te ria ce lls.Sc reening of exce llent LAB s tra ins would have imp ortant s ignificance for p roduing high qua lity yogurt and acce le ra ting indus tria liza tion effic iency.

yogurt;lac tic ac id bac te ria;ac id ity;β-ga lac tos idase

TS252.1

A

1002-0306(2010)01-0189-03

2009-02-27

馬春麗(1978-),女,博士研究生,研究方向:乳品科學。