沙棘葉多糖的提取工藝及抗氧化作用的研究

包怡紅,秦 蕾,王 戈

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.中共黑龍江省委辦公廳,黑龍江哈爾濱 150007)

沙棘葉多糖的提取工藝及抗氧化作用的研究

包怡紅1,秦 蕾1,王 戈2

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.中共黑龍江省委辦公廳,黑龍江哈爾濱 150007)

以沙棘葉多糖得率為指標,通過單因素及正交實驗,對水提、微波輔助及超聲波輔助三種提取方法進行比較,超聲波輔助法的最佳提取條件為:液固比60∶1,超聲波功率700W,超聲波作用時間 40min。在此條件下,超聲波法的最佳提取率為 7.50%,高于微波法的最佳提取率 7.05%和水提法的最佳提取率 6.24%。實驗結果表明:沙棘葉多糖具有一定的體外抗氧化能力,其中當多糖濃度為 1200μg/mL時,對·的清除率比同濃度的VC還高 18.92%。

提取,多糖,沙棘葉,體外抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉 俄羅斯大果沙棘,采于黑河市林業局;石油醚、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醇、硫酸亞鐵 天津市東麗區天大化學試劑廠;苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀 天津市耀華化學試劑有限責任公司;其余試劑 均為國產分析純;總抗氧化活性(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;JY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WD800(MG-5531SD)微波爐 樂金電子 (天津)電器有限公司; SHB-3旋轉蒸發儀 鄭州杜甫儀器廠;T6-新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TDL-40B-W臺式低速大容量離心機 湖南星科科學儀器有限公司;ALPHA1-2冷凍干燥機 德國CHR IST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘葉多糖的提取工藝流程 沙棘葉→粉碎、過篩(60目)→石油醚脫脂→微波或超聲波輔助處理→水浴浸提→脫蛋白→脫色→透析→濃縮→醇沉→冷凍干燥→沙棘葉多糖(備用)

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制作 采用苯酚 -硫酸法[4]。

1.2.3 總還原糖含量的測定 準確吸取 1.0mL提取液于 100mL容量瓶中,加蒸餾水定容;取 2.0mL稀釋液于試管中,加入 6%的苯酚 1.0mL,98%的濃硫酸5.0mL,靜置 10min后搖勻,室溫放置 20min,然后在490nm波長處比色,通過標準曲線方程計算多糖含量及提取率。

1.2.4 單因素及正交實驗設計

1.2.4.1 水提法 水提法以液固比、提取溫度和提取時間為單因素,分別研究各單因素的不同水平對多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎上,按 L9(33)進行正交實驗,以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.4.2 微波輔助法 微波輔助法以液固比、微波作用時間、微波功率為單因素,分別研究各因素的不同水平對多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎上,按L9(33)進行正交實驗,以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.4.3 超聲波輔助法 超聲波輔助法以液固比、超聲波功率、超聲波作用時間為單因素,分別研究各因素的不同水平對多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎上,按L9(33)進行正交實驗,以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.5 沙棘葉多糖體外抗氧化指標的測定

1.2.5.1 清除羥自由基 (·OH)能力的測定[5-6]在10mL的試管中依次加入 6mmol/L的 FeS O4溶液 1mL, 6mmol/L的 H2O2溶液 1mL,濃度為 200～1000μg/mL的待測溶液 1mL,搖勻,靜置 10min,再加入 6mmol/L的水楊酸溶液 1mL,搖勻,靜置 30min后于 510nm波長處測其吸光度。

式中:A1為空白對照的吸光度;A2為無水楊酸時加入待測液的吸光度;A3為加入待測液的吸光度。

1.2.5.2 總抗氧化活性 (T-AOC) 根據總抗氧化能力試劑盒測定。定義在 37℃時,每分鐘每毫升樣品使反應體系的吸光度(OD)值每增加 0.01時,為一個總抗氧化能力單位U。

1.2.5.3 超氧陰離子 (O2-·)清除率的測定[7]采用鄰苯三酚自氧化法測定。在試管中依次加入 4.5mL 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.2,內含 2mmol/L EDT A)緩沖溶液,4.2mL雙蒸水,于 25℃恒溫 20min后,加入25℃預熱過的0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚溶液,迅速搖勻,在波長 325nm波長處每 30s測定一次吸光度,計算線性范圍內每分鐘吸光度的增值,此即為鄰苯三酚的自氧化速率A0。

沙棘葉多糖 (對照 VC)抗氧化活性測定按上述操作,加入鄰苯三酚前,先加入一定量多糖溶液,并減少同體積雙蒸水,其它操作均與上述相同,所測吸光度為Ai。

1.2.5.4 總還原力的測定[8]采用鐵氰化鉀法測定。在 2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖溶液 (pH 6.6)中加入2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液和 1mL樣品。混合物在50℃水浴中反應 20min后,迅速冷卻并加入 2.5mL 10%的三氯乙酸,混勻后以 3000r/min離心 10min。取 1mL上清液加入 0.2mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻,再加入 1mL蒸餾水搖勻,以蒸餾水調零,在700nm波長處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

稱取葡萄糖 0.020g于 500mL容量瓶中定容,即為葡萄糖標準溶液,取 2.0mL蒸餾水作為空白樣,依次取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL葡萄糖標準溶液,用蒸餾水補足 2.0mL,在 9個樣品中加入 6%的苯酚 1.0mL,98%的濃 H2SO45.0mL,靜置 10min后搖勻,室溫放置 20min,然后在 490nm波長處比色,結果如圖1所示。

圖 1 葡萄糖溶液標準曲線

2.2 三種提取方法的比較結果分析

2.2.1 水提法工藝條件的確定

2.2.1.1 水提法單因素實驗結果 如圖 2所示,液固比對沙棘葉多糖提取率的影響最大,多糖得率隨著液固比的增加而增加,當液固比為 50∶1時,多糖得率為 5.44%,之后其變化趨于穩定,此時多糖成分已基本溶出;隨著提取溫度的升高,多糖得率也在逐漸增加,當提取溫度為 90℃時,多糖得率達到 5.49%,之后其變化趨于穩定;當提取時間大于 3h時,多糖得率的增加也已不再明顯。

2.2.1.2 水提法正交實驗結果 為了獲得最佳工藝條件,利用正交“均衡分散”的特點,根據單因素實驗結果,按 L9(33)進行正交實驗設計,結果如表 1所示。

圖 2 水提法各因素對沙棘葉多糖得率的影響

由表 1可知,3個因素對多糖得率的影響中,液固比的影響最為顯著,其次是提取溫度和提取時間。最佳提取工藝條件為A3B2C3,即液固比 60∶1,提取溫度 90℃,提取時間 4h,經驗證實驗,測得樣品多糖含量為 6.24%,證實為最優組合。

表 1 水提法正交實驗設計及結果分析

2.2.2 微波輔助提取法工藝條件的確定

2.2.2.1 微波輔助法單因素實驗結果 如圖 3所示,多糖得率隨著液固比的增加而增加,當液固比大于50∶1時,多糖得率的變化已基本穩定,說明此時沙棘葉中的水溶性多糖已基本溶出;當微波作用時間為3.5min時,多糖得率達 7.03%,之后繼續延長微波作用時間,由于反應容器不密閉,高溫使部分溶劑揮發,故導致提取率隨之下降;當微波功率為 480W時,多糖得率增加到 7.03%,其后隨著功率的增加,溶劑揮發也過多,使液固比降低,故多糖得率也隨之下降。

圖 3 微波輔助法各因素對沙棘葉多糖得率的影響

2.2.2.2 微波輔助法正交實驗結果 由表 2可知,3個因素對多糖得率的影響依次為:微波功率 >液固比 >微波作用時間。此法的最佳提取工藝條件為A1B2C2,正是正交實驗設計中的第二組合,即液固比40∶1,微波作用時間 3.5min,微波功率 480W,此條件下多糖得率為 7.05%,證實為最優組合。

表 2 微波輔助法正交實驗設計及結果分析

2.2.3 超聲波輔助提取法工藝條件的確定

2.2.3.1 超聲波輔助法單因素實驗結果 如圖 4所示,沙棘葉多糖的得率隨著液固比的增加而增加,當其達到 50∶1時,原料中的水溶性多糖已基本溶出,其后隨著液固比的增加,多糖得率的變化已基本平穩;在超聲波功率為 600W時,多糖的得率達 7.36%,之后隨著作用功率的增加,多糖得率開始下降,這是由于超聲波產生的空化、震蕩作用,雖可加強細胞內物質的釋放、擴散及溶解,但過大的超聲波功率也可使部分多糖發生降解[9-10];超聲波作用時間對多糖得率的影響最小,多糖得率隨著其增加而增加,當作用時間超過 40min時,多糖得率的增加幅度已減小。

圖 4 超聲波輔助法各因素對沙棘葉多糖得率的影響

2.2.3.2 超聲波輔助法正交實驗結果 為了獲得最佳工藝條件,利用正交“均衡分散”的特點,根據單因素實驗結果,按L9(33)進行正交實驗設計,結果如表3所示。

由極差分析可知,3個因素對多糖的影響依次為:液固比 >超聲波功率 >超聲波作用時間。最佳提取工藝條件為A2B2C2,即液固比 50∶1,超聲波功率600W,超聲波作用時間 40min,經驗證實驗測得此條件下的多糖得率為 7.50%,證實為最優組合。

表 4 沙棘葉多糖及VC的還原力測定結果

表 3 超聲波輔助法正交實驗設計及結果分析

2.2.4 三種提取方法的結果比較 見圖 5。

圖 5 三種提取方法的多糖得率的比較

2.3 沙棘葉多糖體外抗氧化指標的測定結果分析

2.3.1 清除羥自由基能力的結果分析 如圖 6所示,濃度為 200～2000μg/mL的沙棘葉多糖對·OH的清除率隨其濃度的增加而增加,2000μg/mL的多糖溶液對·OH的清除率為 90.09%,明顯接近于同濃度的VC溶液的·OH清除率 99.72%。沙棘葉多糖對·OH具有很強的清除作用,說明它具有一定的體外抗氧化活性。

圖 6 不同濃度沙棘葉多糖及VC對·OH的清除作用

2.3.2 總抗氧化活性 (T-AOC)的結果分析 如圖 7所示,沙棘葉多糖的總抗氧化能力隨其濃度的增加而增加,在濃度為 2000μg/mL時抗氧化能力已達到86.33U/mL,但是明顯小于同濃度的 VC抗氧化能力252.96U/mL。

2.3.3 清除超氧陰離子能力的結果分析 如圖 8所示,沙棘葉多糖對·的清除率隨其濃度的增加而增加,在 1000μg/mL時已達到 98.65%,高于同濃度的VC對·的清除率 70.27%,當濃度大于 1200μg/mL時清除率達到 100%,說明沙棘葉多糖具有很高的清除率。

圖 7 不同濃度沙棘葉多糖及VC的總抗氧化能力

圖 8 不同濃度沙棘葉多糖及VC對·的清除作用

2.3.4 還原力測定的結果分析 如表 4所示,濃度為200～2000μg/mL的沙棘葉多糖的還原力隨其濃度的增加而增強,但變化不大,而且明顯低于同濃度的VC溶液的還原力。雖然 2000μg/mL沙棘葉多糖的還原力比 200μg/mL的VC溶液還要略低一些,但已表明沙棘葉多糖具有一定的還原力。

3 結論

3.1 水提取法的最佳工藝條件為:液固比 60∶1,浸提溫度 90℃,浸提時間 4h,經驗證實驗測得樣品多糖得率為 6.24%,各因素對多糖得率的影響順序為:液固比 >提取溫度 >提取時間。

3.2 微波輔助提取法的最佳工藝條件為:液固比40∶1,微波作用時間 3.5min,微波功率 480W,此條件下多糖得率為 7.05%,各因素對多糖得率的影響順序為:微波功率 >液固比 >微波作用時間。

3.3 超聲波輔助提取法的最佳工藝條件為:液固比60∶1,超聲波功率 700W,超聲波作用時間 40min,此條件下多糖得率為 7.50%,各因素對多糖得率的影響順序為:液固比 >超聲波功率 >超聲波作用時間。

3.4 本實驗中沙棘葉多糖的四項體外抗氧化能力均隨其濃度的增加而增加,與同濃度的 VC溶液相比,具有明顯的總抗氧化能力和清除·OH的能力,其中對·的清除作用比同濃度的 VC溶液還高18.92%,還原力雖比同濃度的 VC溶液低,但已表明沙棘葉多糖具有一定的體外抗氧化能力。

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Study of extraction and antioxidant of polysaccharide fromH ippohae rham noidesL.leave

BAO Y i-hong1,QIN Lei1,WANG Ge2
(1.College of Forest,Northeast ForestUniversity,Harbin 150040,China; 2.GeneralOffice of the CPC Heilongjiang Province Committee,Harbin 150007,China)

Taking the ra te of p olysaccha ride from Hipp ohae rham noides L.leaves as eva lua tion index,and through s ing le fac tor and orthogona l tes ts,the three m e thods of extrac tion:wa te r,m ic rowave-ass is ted and ultrasonicass is ted,we re comp a red.The results showed the bes t ultrasonic-ass is ted extrac tion ra te of7.50%,highe r than the m ic rowave m e thod the bes t ra te of7.05% and wa te r m e thods the bes t ra te of6.24%.The bes t cond itions of ultrasonic extrac t m e thods we re as follows:liquid-solid ra tio60∶1,the ultrasonic p owe r700W,ultrasonic t im e 40m in.The p olysaccha ride extrac ted from Hipp ohae rham noides L.leave had ce rta in deg ree antioxidant cap ac ities in vitro,for examp le,when the concentra tion of p olysaccha ride was1200μg/mL,the rem ova l effec t towa rds· was of highe r than VCby18.92%。

extrac tion;p olysaccha ride;Hipp ohae rham noides L.leave;antioxidant in vitro

TS201.2

A

1002-0306(2010)01-0286-05

沙棘 (Hippophae rham nosidesL.)屬于胡頹子科沙棘屬植物,落葉灌木或小喬木,又名沙棗、酸柳。我國華北、西北、西藏、云南等地均有分布,是沙棘資源最豐富的國家[1]。沙棘是較好的綠化植物,同時也具有較高的營養價值,它主要體現在食品開發和藥品開發等方面[2]。沙棘油是各種生命活性物質的濃縮物,在現代醫學中有廣泛用途;沙棘莖皮可提取抗癌物質;沙棘花是很好的蜜源等。目前,我國沙棘的加工工藝和設備都相對簡單,隨著沙棘產品數量的日益擴大,其不被重視和利用的沙棘葉和沙棘粕等也越來越多。近年來除少量供藥用外,大量用于多種保健飲料的配制[3]。盡管如此,關于沙棘葉中多糖的研究仍報道很少,為此,本實驗對沙棘葉水溶性多糖的提取進行了研究,對比了水提、微波輔助及超聲波輔助三種提取方法的提取效果,且對其體外抗氧化能力進行研究,旨在為進一步研究沙棘葉多糖的構效關系提供依據。

2009-10-26

包怡紅 (1970-),女,教授,博士后,研究方向:林副產品深加工與食品微生物資源開發利用。