麥芽根提取5′-磷酸二酯酶對RNA酶解工藝研究

鄧義熹,趙 劼,張亞雄,姚 鵑,李知洪

(1.三峽大學生物工程重點實驗室,湖北宜昌 443002; 2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

麥芽根提取5′-磷酸二酯酶對RNA酶解工藝研究

鄧義熹1,趙 劼2,張亞雄1,姚 鵑2,李知洪2

(1.三峽大學生物工程重點實驗室,湖北宜昌 443002; 2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

從麥芽根提取中的 5′-磷酸二酯酶,原酶液酶活達到 300U/mL。將提取的酶液用于水解酵母 RNA,得到5′-AMP、UMP、CMP、G MP四種核苷酸,并系統研究了麥芽根 5′-磷酸二酯酶對核酸的酶解條件。結果表明,最佳反應條件為:底物濃度 3%,酶用量 5%,溫度 68℃,pH6.5,水解時間為 4～5h,在此條件下,酶解率可以達到 84%。在酶解 2h內補加RNA底物可提高酶利用率。

麥芽根,5′-磷酸二酯酶,5′-核苷酸,酶解率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥麥芽根 蘭州黃河啤酒廠;RNA底物 國藥集團化學試劑有限公司,生物試劑;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鉬酸銨、高氯酸、硫酸鎂、硫酸鋅 均為國產分析純。

恒溫水浴鍋 DKU-20型,上海精密儀器實驗設備公司;高速冷凍離心機 CR21G,日立公司;紫外可見分光光度計 UV-2082H,尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜儀 1200 安捷倫。

1.2 分析方法

1.2.1 酶活測定 采用紫外分光光度法,參照文獻[5],并略作修改。

1.2.2 四種核苷酸含量的測定 參照行業標準QB2582-2003。

1.2.3 干物質 (DS)測定 參照國標 GB/T5009.3 -2003。

1.2.4 總蛋白測定方法 參照國標 GB/T5009.5 -2003。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶提取方法 選取儲存于干燥通風處的麥芽根,經粉碎機粉碎后過 60目篩,按一定料液比加水,并加入 0.5mol/L MgSO4,特定溫度浸提 12h,浸提液離心后得上清即為粗酶液,測定酶活單位。

1.3.2 RNA水解工藝 稱取定量 RNA底物,溶于100mL去離子水,調 pH至酶最適 pH,70℃水浴中保溫,預熱至恒溫后,按 20U/mL加入 5′-磷酸二酯酶粗酶液,反應 4～5h。反應完畢后,升溫至 90℃,保溫10min滅酶,冷卻離心,濃縮后測定四種核苷酸含量[7],計算酶解率,計算公式如下:

酶解率 =水解液中四種核苷酸含量 (g/kg)× RNA底物溶液干物質濃度 (%)/水解液干物質濃度(%)×RNA底物的濃度(g/kg)×100%

2 結果與討論

2.1 酶解條件的研究

2.1.1 不同底物濃度對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 分別配制 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%不同濃度 RNA底物溶液,68℃水解 5h后,測定水解液的核苷酸含量,計算酶解 RNA底物的酶解率。結果表明,提高 RNA底物濃度有利于酶解率的提高,但高濃度的 RNA底物濃度會抑制核酸酶 P1的作用,可以看出,隨著 RNA底物濃度的增加,酶解率也逐漸增加,但在一定的酶濃度情況下,繼續增加 RNA底物的濃度,由于相對酶濃度變小,酶解率也開始下降,RNA底物濃度為 5%時,酶解率最高達到 84%,底物濃度超過8%時,酶解率僅有 50%。

圖 1 不同濃度底物對酶解率的影響

2.1.2 不同 pH對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響分別配制 pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的RNA底物,在 68℃反應 5h后,測定酶解液的核苷酸含量,計算酶解 RNA底物的酶解率。結果如圖 2, 5′-磷酸二酯酶在 pH5～7之間水解效果較好,其中pH6.5水解效果最好,酶解率達到 83%。pH低于 5或超過 7時,酶解效率明顯降低,這可能是由于偏堿或偏酸性的反應環境會影響酶的構象,影響 5′-磷酸二酯酶與 RNA底物結合[8],從而降低酶解速率,尤其當 pH大于 7時,酶解能力迅速下降,說明此酶對堿性環境非常敏感。

圖 2 pH對酶解率的影響

2.1.3 不同反應溫度對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 分別在 55、60、65、70、75、80℃水浴條件下做酶解實驗,5h后滅酶測核苷酸含量。5′-磷酸二酯酶是一種鋅酯酶,在鋅離子存在條件下,熱穩定性很好,且酶促反應溫度較高[9]。從圖 3可以看出,5′-磷酸二酯酶在溫度低于 65℃時水解 RNA能力較差;高于65℃后,隨著溫度的升高,水解能力顯著增強,在65～75℃之間達到最高值 83%;溫度繼續升高,酶解能力開始下降,這可能是由于溫度過高導致酶失活。

圖 3 水解溫度對酶解率的影響

2.1.4 不同反應時間對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 配制一定濃度的 RNA底物溶液,在 68℃進行酶解反應,每隔 1h取樣測定酶解液中的核苷酸含量,計算酶解率。結果如圖 4,酶解反應在最初的 1h最快,1h時酶解率達到 70%,隨著水解的繼續進行,水解液的核苷酸得率繼續提高,但在3～4h后核苷酸含量基本不變,酶解率達到最高 82%。因此,為了確保高的水解率,選擇4h作為核酸水解的最佳工藝時間。

圖 4 反應時間對酶解率的影響

2.1.5 不同加酶量對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響配制一定濃度的RNA底物,分別按3%、5%、8%、10%、15%、20%的比例添加酶活為 300U/mL的酶液,68℃水浴條件下反應 4h滅活,測水解液核苷酸含量。通常,在酶促反應中增加酶濃度有利于反應向轉化產物的方向進行,但在底物濃度一定的情況下,過高的酶濃度并不能一直提高反應速率[10]。由圖 5可以看出,隨著 5′-磷酸二酯酶酶液使用量的增加,水解液中核苷酸含量也逐漸增加,當原酶液添加量達到 10%時,提高酶量不能提高酶解率,此時酶促反應達到最大速率。

圖 5 添加酶量對酶解率的影響

2.2 補加 RNA底物對最終酶解率的影響

在水解過程中,隨著反應的進行,底物濃度逐漸降低,酶促反應速率也相應降低。反應進行一段時間后補加一定量的底物是提高酶促反應效率的有效方法。實驗中分別在酶解反應進行到 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h時添加與初始底物濃度相等的 RNA底物,繼續水解到 5h后測定水解液中核苷酸含量,如圖 6,在不添加 RNA底物的情況下,水解反應進行到2h后,水解產物中核苷酸含量達到最高水平,從圖 7可以看出,在 2h前添加相應量的底物,水解率基本保持在 85%以上,隨著水解時間的延長,核酸酶開始失活,酶濃度降低,再添加底物并不能有效的提高總體的酶解得率。所以,在酶解反應開始的 2h內添加一定量的底物有利于酶解效率的提高。

圖6 補加RNA對酶解率的影響

2.3 兩種酶水解效果及性價比研究

配制 1g/100mL RNA水溶液 (RNA純度約為90%),分別加 0.08%的 5′-磷酸二酯酶“RP-1”(日本天野酶)和麥芽根提取原酶液 5%(V/V),在 68℃水解 4～5h,水解液 5000r/min離心 10min后,取上清液濃縮至一定倍數,檢測水解濃縮液中的四種核苷酸含量及干物質[7],計算酶解率。

由表 1可知,比較兩種酶解液中核苷酸含量表明,兩種 5′-磷酸二酯酶的酶解效果都較好,四種核苷酸含量基本相同,酶解率都達到 85%以上。另外,比較圖 7和圖 8可以看出,兩種酶解液中,雜峰都較低,峰型基本一致,這表明麥芽根提取 5′-磷酸二酯酶在核酸水解方面完全能夠達到天野酶的效果。

表 1 兩種酶的水解結果比較

圖7 HPLC測定“RP-1”酶水解RNA后四種核苷酸

圖 8 HPLC測定麥芽根提取 5′-磷酸二酯酶水解RNA后四種核苷酸含量

3 結論

3.1 從啤酒大麥麥芽根里提取 5′-磷酸二酯酶成本低,生產工藝簡單,提取酶活可以達到 300U/mL。

3.2 用 5′-磷酸二酯酶水解酵母 RNA生成 5′-核苷酸。綜合考慮放大生產成本,生產條件及產品風味因素,相對調整各單因素實驗結果,因而采用底物濃度為 3g RNA/100mL溶液,酶用量為 5%(V/V),酶解溫度為 68℃,pH6.5,酶解時間 4～5h時,5′-核苷酸的酶解率達 84%。工業上為了提高酶的利用率,可在水解反應前期 2h內補加相應量的 RNA底物。

3.3 麥芽根提取的 5′-磷酸二酯酶酶活穩定,成本較低,可用于工業生產上降解酵母 RNA得到四種單核苷酸,用于食品添加劑、醫藥等領域。

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Study on the process of RNA hydrolysis by 5′-phosphodiesterase extracted from barley rootlet

DENG Y i-xi1,ZHAO Jie2,ZHANG Ya-xiong1,YAO Juan2,L I Zhi-hong2
(1.KeyLaboratory ofBio-engineering,China Three GorgesUniversity,Yichang 443002,China; 2.Angel Yeast Co.,Ltd,Yichang 443003,China)

Extrac tion of5′-p hosp hod ies te rase from ba rley rootle t was conduc ted.The enzym e ac tivity ob ta ined was 300U/mL.W hen ribonuc le ic ac ids from yeas t we re d iges ted w ith the enzym e solution,4kinds of nuc leotides, 5′-AM P、UM P、CM P and GM P we re resulted.The op t im um cond itions for the reac tion we re as follows:concentra tion of subs tra te RNA3%,sum of enzym e solution5%(V/V),d iges tion temp e ra ture68℃,pH6.5,reac tion t im e4～5h, the yie ld of5′-nuc leotide a tta ined84%.The utiliza tion of the enzym e was ra ised by feed ing w ith RNA w ithin2h.

ba rley rootle t;5′-p hosp hod ies te rase;5′-nuc leotide;enzym e-deg rada tion ra te

TS201.3

A

1002-0306(2010)01-0207-03

5′-磷酸二酯酶廣泛存在于植物及動物臟器中,還可由微生物發酵獲得,此酶可用于降解酵母 RNA生產核苷酸。而核苷酸類物質是重要的鮮味呈味來源[1],日本最早開始核苷酸類鮮味劑生產,并于上世紀 60年代后期成為核苷酸類物質的最大生產國。目前,核苷酸類物質及其衍生物的應用己遠遠超出調味增鮮范圍,其在抗病毒和抗癌瘤的作用受到醫藥界的重視[2]。目前,生產核苷酸的方法主要有水解法、發酵法、化學法、酶促合成法、提取法和自溶法[3],其中,利用 5′-磷酸二酯酶水解核酸生產核苷酸是最簡便、最易控制的途徑,但由于食品級 5′-磷酸二酯酶在全球只有一家生產商 (天野特種酶制劑),因而價格奇高,是其他食品用酶的數倍,這也造成核苷酸類產品價格的居高不下。傳統 5′-磷酸二酯酶生產方法是桔青霉發酵培養[4],但工藝復雜,且霉菌孢子容易造成污染。麥芽根是啤酒大麥芽生產中的副產物,其中含有豐富的 5′-磷酸二酯酶[6]。因此,可從麥芽根中提取 5′-磷酸二酯酶。本文主要研究將從麥芽根中提取 5′-磷酸二酯酶用于酵母 RNA酶解生產5′-核苷酸,并通過改進和優化酶解條件及工藝,提高酶解效率。

2009-11-11

鄧義熹 (1985-),男,碩士研究生,研究方向:微生物代謝工程。