應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析肝癌患者血清蛋白質(zhì)譜的手術(shù)前后變化

王秀麗，高春芳，趙 光，馬 波，李冬暉

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在許多地區(qū)其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。對(duì)于具有典型臨床表現(xiàn)者其診斷并不困難，但這時(shí)患者往往已界中晚期，預(yù)后不佳。因此原發(fā)性肝癌的早期診斷和治療一直為臨床和科研工作者所關(guān)注，而尋找具有高靈敏度和高特異性的原發(fā)性肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物則是原發(fā)性肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在。筆者利用SELDI-TOF-MS（表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜）技術(shù)對(duì)肝癌患者手術(shù)前后血清蛋白質(zhì)譜的變化進(jìn)行分析對(duì)比，旨在篩選可用于原發(fā)性肝癌早期臨床診斷和預(yù)后判斷的特異性生物標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 本組原發(fā)性肝癌患者（經(jīng)影像檢查或術(shù)后病理診斷確診）47例，年齡36～71歲，平均56歲；男女比例為4.8∶1。正常健康人（對(duì)照組）81名為正常體檢者，年齡30～70歲，平均50歲；男女比例為2.8∶1。所有患者術(shù)前及術(shù)后15 d清晨空腹無菌采靜脈血2 ml，血清標(biāo)本于-80℃冷凍保存。同時(shí)，對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行AFP（甲胎蛋白）測定分析。以上血清標(biāo)本來源均為2007-10～2008-12在筆者所在醫(yī)院住院及門診患者，患者組與對(duì)照組均無引起血清中蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化的其它相關(guān)疾病。

1.2 試劑和儀器 尿素、 乙腈（acetonitrile，ACN）、三氟乙酸（trifluoro-acetic，TFA）、芥子酸（sinapinic acid，SPA）、三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl）、3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸（CHAPS）及羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）等均購自美國Sigma公司。SELDI蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)（PBSⅡ-C）及其配套的金屬親 和 表 面 （immobilized metalaffinity capture,IMAC30）銅離子芯片均購自美國Ciphergen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的準(zhǔn)備 4℃融解血清，1 000 r/min離心10 min；取20μl血清，置于1.5 ml離心管中；加40 μl U9 緩沖液 （含 9 mol/L 尿素、2%CHAPS、50 mmol/L Tris-HCl，pH9.0）；4 ℃振蕩 30 min， 使蛋白質(zhì)變性；取20 μl變性后的樣品，每管加入240 μl U1緩沖液 （U9緩沖液9倍稀釋而成）；4℃振蕩30 min。使最后上樣的血清稀釋約40倍。

1.3.2 芯片的預(yù)處理及與血清蛋白的結(jié)合 芯片每孔加100 mmol/L硫酸銅50 μl，室溫下200×g振蕩5 min，傾除硫酸銅；用去離子水沖洗5次后甩干，每孔中加入 100 mmol/L 醋酸鈉（pH4.0）50 μl，室溫下200×g振蕩5 min；去離子水沖洗5次后芯片每孔加入結(jié)合／洗脫緩沖液 （含100 mmol/L磷酸鈉、500 mmol/L 氯化鈉，pH7.0）150 μl， 置于振蕩器上，室溫孵育5 min后除去緩沖液，重復(fù)1次，后每孔加入50 μl稀釋好的血清樣品，置于振蕩器上，4℃孵育60 min后除去緩沖液；接著用150 μl結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗2次，每次振蕩5 min，最后1次用1 mmol/L HEPES(pH7.0)快速?zèng)_洗。取出芯片，待芯池即將風(fēng)干時(shí)，加入飽和SPA（SPA1mg溶于15 μl 50%ACN、15 μl 1%TFA 中）2 次，0.5 μl/次。 風(fēng)干后上機(jī)檢測。

1.3.3 芯片檢測與數(shù)據(jù)收集處理 ELDI蛋白芯片質(zhì)譜儀在檢測樣品蛋白質(zhì)指紋譜前用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片校正，使誤差＜0.1%。檢測時(shí)設(shè)定SELDI-TOF-MS的激光強(qiáng)度為175，靈敏度為8，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比(M/Z)范圍為2 000～20 000，收集位置20～80。用Ciphergen ProteinChip 3.2.0軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，用Biomarker Wizard軟件對(duì)芯片檢測得到的蛋白質(zhì)相對(duì)含量及蛋白質(zhì)質(zhì)菏比（M/Z）數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過方差分析計(jì)算兩組具有相同M/Z蛋白質(zhì)峰波強(qiáng)度，并用P值表明其差異程度。

1.3.4 分類樹鑒別診斷模型的建立 數(shù)據(jù)挖掘軟件Biomarker Patterns Software 4.0對(duì)數(shù)據(jù)分組及相關(guān)性進(jìn)行分析，建立用于肝癌診斷的最優(yōu)決策分類樹模型。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌術(shù)前組與正常對(duì)照組血清樣品蛋白質(zhì)譜的分布結(jié)果 ①峰波檢測 （Peak Detection）：設(shè)定47例肝癌患者術(shù)前血清樣品與對(duì)照組81人血清樣品檢測的蛋白質(zhì)分子量區(qū)間在1 500～20 000 Da，低于1 500 Da的蛋白質(zhì)或肽段將自動(dòng)從波譜中被清除，因在0～1 500 Da這一區(qū)間可存在加合物、試劑成分、SPA以及其它化學(xué)成分，影響后續(xù)的數(shù)據(jù)分析；利用PBSⅡ型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀對(duì)IMAC30芯片進(jìn)行檢測，所得到的蛋白質(zhì)以波譜的形式表示；②波峰整合（Peak alignment）與蛋白質(zhì)譜分析：采用Biomarker Wizard軟件對(duì)所得波譜進(jìn)行分析，術(shù)前組與正常對(duì)照組血清樣品中大多數(shù)蛋白質(zhì)峰的表達(dá)量都是基本相同的，但兩組之間仍有32個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量具有一定判斷差別，其中有28個(gè)蛋白質(zhì)峰在術(shù)前組與正常組比較時(shí)有顯著性差異 （P＜0.01），在這28個(gè)具有表達(dá)差異的蛋白質(zhì)中，術(shù)前患者組血清中高表達(dá)量的蛋白質(zhì)占5個(gè)，它們的平均分子量分別為4472.59、8 134.96、8 942.49、8 242.58、4 064.56 Da；與正常對(duì)照組相比較，蛋白表達(dá)量下調(diào)的有23個(gè)（表1）；③肝癌血清蛋白標(biāo)志物的篩選及其模板的建立和分析：利用Biomarker Patterns軟件對(duì)檢測得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，建立了由M/Z為9 294.93 Da這個(gè)蛋白質(zhì)所組成的最優(yōu)分類樹模型（圖1），可以正確地將肝癌患者與正常人分組；該模型中節(jié)點(diǎn)1為母節(jié)點(diǎn)，包括了所有用于建立模型的受檢樣本（128例）；節(jié)點(diǎn)處的判別函數(shù)（各系數(shù)與括號(hào)內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量的積）為：在節(jié)點(diǎn)1處如M9 294.93≤4.993，歸終節(jié)點(diǎn)1，否則為終節(jié)點(diǎn)；該模板診斷肝癌的敏感性為97.9%（46/47），特異性為97.5%（79/81）。

圖1 肝癌組與對(duì)照組血清蛋白圖譜分類樹模型Node為結(jié)點(diǎn)；Terminal Node為終結(jié)點(diǎn)；N代表樣本數(shù)，M代表蛋白質(zhì)質(zhì)荷比

表1 肝癌術(shù)前組和正常對(duì)照組血清質(zhì)譜中差異蛋白的表達(dá)

2.2 肝癌患者術(shù)前與術(shù)后血清蛋白質(zhì)譜的變化

在相同條件及參數(shù)下，應(yīng)用IMAC30蛋白質(zhì)芯片和Biomarker Wizard軟件對(duì)肝癌術(shù)后患者血清分析，并與術(shù)前組和正常對(duì)照組的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)M/Z為5 909.79、5 930.91、6 116.71、7 574.51、8 134.96、5 972.61、4 064.55、11 727.26、5 342.65 Da的蛋白表達(dá)量在術(shù)后均明顯下降，與正常對(duì)照組蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度相當(dāng)，無顯著性差異，與術(shù)前組比較具有非常顯著性差異（P＜0.01），見表2。

3 討 論

肝癌分為原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌。在原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，常簡稱為肝癌）最為多見，約占95%，其次是膽管細(xì)胞癌（cholangiocarcinoma）。肝癌是全球第五位常見癌癥，占所有癌癥的5.6%，全球每年的新病癥約為564 000例[1～3]。肝癌亦是我國癌癥中的第二號(hào)殺手，全球50%以上的肝癌發(fā)生在我國。罹患肝癌的高危人群以35～65歲的中年人為主，尤其以男性患者較多，是女性的2～4倍。高達(dá)80%～90%的肝癌患者同時(shí)有肝硬化。慢性乙型、丙型肝炎病毒是其最主要的病因（約80%），其次是酒精、藥物、攝食含有黃曲霉素的食物等[3～5]。全球80%～85%的肝癌與乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）感染有關(guān)，而 HBV陰性者中絕大多數(shù)有丙型肝炎病毒(HCV)的感染。約15%～40%的慢性HBV感染個(gè)體最終死于肝硬變和(或)肝癌[6]。上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所對(duì)18 816例患者進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照研究 （randomized controlled trial，RCT），對(duì)高危人群每 6個(gè)月監(jiān)測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和腹部超聲發(fā)現(xiàn)肝癌篩查有助于降低肝癌病死率37%[7]。但是AFP是一種敏感性與特異性較低的生物標(biāo)記，而超聲檢查又過多依賴于操作者的工作經(jīng)驗(yàn)[8]。同時(shí)，臨床常用的AFP檢測若出現(xiàn)陽性，絕大多數(shù)表明肝癌已經(jīng)發(fā)生，其它血清學(xué)指標(biāo)尚缺乏可靠性。肝癌發(fā)生的機(jī)理甚為復(fù)雜，至今發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)異常十分多見，但尚未據(jù)此形成更為可靠的預(yù)測措施[9]。

表2 47例肝癌患者手術(shù)前后血清質(zhì)譜中差異蛋白的表達(dá)

血清蛋白質(zhì)組的研究能獲得大量的、完整的和動(dòng)態(tài)的血清蛋白質(zhì)譜。而每種疾病在癥狀出現(xiàn)之前及不同的發(fā)展階段，都有其獨(dú)特的蛋白質(zhì)變化，分析這些早期發(fā)生的蛋白質(zhì)變化，有望獲得臨床早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。筆者利用SELDI-TOF-MS技術(shù)，對(duì)47例原發(fā)性肝癌患者手術(shù)前后血清標(biāo)本與81名正常體檢血清樣本分別進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在肝癌組與正常對(duì)照組之間存在28個(gè)有顯著差異的蛋白質(zhì)峰，其中5個(gè)蛋白在肝癌組明顯上調(diào)，23個(gè)下調(diào)；肝癌治療前后存在顯著差異的蛋白峰25個(gè)，均表現(xiàn)為明顯下調(diào)。

將血清蛋白質(zhì)譜建立數(shù)據(jù)庫，利用Biomarker Wizard統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，以M/Z值為9 424.93 Da的蛋白質(zhì)建立診斷模型可將正常人與肝癌患者準(zhǔn)確的分組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用SELDITOF-MS質(zhì)譜技術(shù)可以篩選出原發(fā)性肝癌與正常人群之間血清中表達(dá)有差異的特異性生物標(biāo)志物，并且對(duì)肝癌患者預(yù)后判斷分析具有重要臨床意義。

[1]Lau WY.Primary hepatocellular carcinoma[M].In:Blumgart LH&Fong Y.The 2nd eds.Surgery of The Liver and Biliary Tract(VolumeII)，2000.1423-1450.

[2]Bosch FX，Ribes J，Díaz M，et al.Primary liver cancer:worldwide incidence and trends[J].Gastroenterology，2004，127(Suppl):S5-16.

[3]Lai EC，Lau.WY.The continuing challenge of hepatic cancer in Asia[J].Surgeon，2005，3(3):210-215.

[4]Lau WY.Management of hepatocellular carcinoma[J].J R Coll Surg Edinb，2002，47(1):389-399.

[5]Lau WY.Primary liver tumors[J].Semin Surg Oncol，2000，19(2):135-144.

[6]Lok AS，McMahon BJ，Practice Guidelines Committee，American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD).Chronic hepatitis B:update of recommendations[J].Hepatology，2004，39(3):857.

[7]Zhang BH，Yang BH，Tang ZY.Randomized controlled trial of screening for hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol，2004，130(7):417-422.

[8]Spangenberg HC，Thimme R，Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma[J].Semin Liver Dis，2006，26(4):385-390.

[9]吳孟超.肝癌外科治療的近期進(jìn)展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006，13(2):125-128.