融合蛋白GST-Ulp1p在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒定

傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文斌，任桂萍，李璐，李德山

東北農業大學生命科學學院 生物制藥實驗室，哈爾濱 150030

融合蛋白GST-Ulp1p在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒定

傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文斌，任桂萍，李璐，李德山

東北農業大學生命科學學院 生物制藥實驗室，哈爾濱 150030

利用基因工程技術，體外重組小分子類泛素修飾蛋白酶1(Ulp1)的活性片段，獲得高表達、高特異性重組蛋白酶。從釀酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1編碼第403到621個氨基酸殘基之間的DNA片段(Ulp1p)，在其C端加入6×His并連接到大腸桿菌表達載體pGEX中，構建重組表達質粒pGEX-Ulp1p-his6。將重組質粒轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，氨芐青霉素抗性篩選轉化子。表達、純化后，以SUMO融合蛋白檢測其活性。經過優化，該蛋白可溶性表達，表達量占菌體總蛋白的40.12%。可通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱或Ni-NTA凝膠親和層析純化得到純度98%的蛋白。經酶切分析，比活力為1.375×104U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6無需切除谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽，具有很高的活性，制備簡易；6×His標簽，有利于底物蛋白切割后純化，減少蛋白損失。本研究為制備高活力的SUMO蛋白酶提供了一個新方法。

SUMO蛋白酶1(Ulp1)，谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，高效表達，活性鑒定

Abstract:The aim of the study is to obtain an efficient expression of recombinant ubiquitin-like specific protease 1(Ulp1)by gene engineering.We cloned the Ulp1p, active fragment(403 aa?621 aa)of Ulp1, fromSaccharomyces cerevisia, and subcloned into pGEX/Rosetta(DE3)to form an expression plasmid, pGEX-Ulp1p-His6.In order to enhance the solubility of GST-Ulp1p-His6,we purified the fusion protein GST-Ulp1p-His6by either glutathioneS-transferase agarose or Ni-NTA resin chromatography, the purity was up to 98%.We utilized the protein to cleave the SUMO fusions, and the specific activity of GST-Ulp1p-His6was 1.375×104U/mg.This study showed that the recombinant protein GST-Ulp1p-His6displayed high specificity and activity.

Keywords:ubiquitin-like specific protease 1(Ulp1), glutathioneS-transferase(GST), high-level expression, activity identification

小分子類泛素修飾蛋白(Small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)廣泛存在于各種真核細胞中，參與調節細胞凋亡、信號轉導、RNA轉錄、蛋白的核質運輸以及細胞周期等多種生理進程[1]。由SUMO介導的蛋白質翻譯后修飾是對其所修飾的蛋白質功能與定位的一個關鍵性調節機制。近年來，SUMO被發現可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達量以及促進靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[2-3]。……