非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123

非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

陳慧梅，曹廣力，薛仁宇，貢成良

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123

為了建立非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞系，將家蠶核型多角體病毒極早期基因(ie-1)啟動子控制的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表達(dá)盒克隆至 pIZT/V5-His，獲得重組載體pIZT-IE-hGM-CSF，該載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞后，通過博萊霉素(Zeocin)篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系IE-hGM-CSF。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組經(jīng)PCR鑒定，成功檢測到ie-hGM-CSF，Western blotting分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的重組hGM-CSF的大小為22 kDa，ELISA檢測結(jié)果顯示hGM-CSF在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系里的表達(dá)水平大約為2 814.7 pg/106個(gè)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化，pIZT/V5-His，hGM-CSF，BmN細(xì)胞

Abstract:To develop the stable transformants of the silkworm(Bombyx mori)BmN cells that could continuously express the exogenous gene based on a non-transposon vector, an expression cassette containing human granucyto-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF)gene driven byie-1 promoter fromB.morinucleopolyhedrovirus was inserted into pIZT-V5-His to form a recombinant vector pIZT-IE-hGM-CSF, followed by transfecting the constructant into BmN cells, the stable ie-hGM-CSF cell lines were obtained after being selected with Zeocin.PCR result using the genomic DNA of the transformed BmN cells as template illustrated a specific fragment ofie-hGM-CSF, and Western blotting analysis using an antibody against hGM-CSFdemonstrated a specific band with a molecular weight of 22 kDa in the transformed cells,meanwhile, the expression level of hGM-CSF determined by ELISA was about 2 814.7 pg in 106transformed BmN cells.

Keywords:transformation, pIZT/V5-His, hGM-CSF, BmN cells

目前主要通過大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞以及哺乳動物細(xì)胞 4種系統(tǒng)來表達(dá)外源蛋白[1]，這 4大表達(dá)系統(tǒng)在科學(xué)研究、新藥研發(fā)等方面發(fā)揮了巨大的作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)屬于原核表達(dá)系統(tǒng)，具有良好的操作性、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但重組蛋白不能進(jìn)行翻譯后修飾加工，難以獲得高活性的目的蛋白；酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于低級的真核表達(dá)系統(tǒng)，可以進(jìn)行翻譯后加工修飾，但發(fā)生錯(cuò)誤修飾的機(jī)率較高；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過加工修飾表達(dá)的外源蛋白與天然蛋白結(jié)構(gòu)最為接近，但表達(dá)量不高，并且培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞成本高、操作復(fù)雜。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作簡單，易培養(yǎng)，成本相對較低，并且可以進(jìn)行糖基化等修飾，可以生產(chǎn)得到高活性的外源蛋白?！?br>