一種利用分泌型熒光素酶基因表達變化監測活細胞中miRNA活性的新方法

田文洪，董小巖，王剛，吳小兵

1 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052 2 復旦大學生命科學學院 遺傳學研究所 遺傳工程國家重點實驗室, 上海 200433 3 北京五加和分子醫學研究所有限公司，北京 100176

一種利用分泌型熒光素酶基因表達變化監測活細胞中miRNA活性的新方法

田文洪1*，董小巖1,2,3*，王剛1，吳小兵1

1 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052 2 復旦大學生命科學學院 遺傳學研究所 遺傳工程國家重點實驗室, 上海 200433 3 北京五加和分子醫學研究所有限公司，北京 100176

建立了一種以分泌型的熒光素酶Gluc為報告基因的 miRNA傳感器質粒(命名為 Gsensor)監測活細胞中miRNA(microRNA)活性的方法。首先構建了 pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA質粒作為 Gsensor的空載體，同時其中的MCS位點可供插入miRNA的靶序列。以miR142-3p為檢測對象，將1個和3個拷貝的與miR142-3p完全互補靶序列分別插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA中，構建成miR142-3p Gsensor和miR142-3p Gsensor-3。將它們分別轉染至U937細胞中,檢測培養上清中Gluc的表達水平。結果顯示二者均可有效反映 U937細胞中 miR 142-3p的抑制活性(分別與Gsensor空載體相比)，提示Gsensor中采用一個拷貝的miRNA靶序列即可滿足檢測要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142對miR142-3p活性的抑制作用。隨后，分析了時間、轉染劑量對Gsensor檢測結果的影響。結果表明，在U937細胞中miR142-3p Gsensor表現的miR142-3p活性在48 h后趨于穩定；Gsensor轉染劑量在0.001～0.05 pg/cell范圍內不影響其功能。最后，利用miR142-3p Gsensor 檢測了HEK293、U937、K562、SP2/0和P815細胞內miR142-3p活性，結果發現miR142-3p活性在U937、K562、SP2/0和P815細胞中均較高，而在HEK293中幾乎沒有活性。用 QRT-PCR方法檢測miR142-3p的相對拷貝數。結果表明，在HEK293、U937和 K562細胞中，miR142-3p活性與其相對拷貝數呈正相關?！?br>