抗重金屬汞離子抗體的制備及鑒定

趙麗，王鳳龍，楊慧，李鵬，劉滿杏，李霞,3

1 內蒙古農業大學動物科學與醫學學院，呼和浩特 010018

2 北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097

3 北京農產品質量檢測與農田環境監測技術研究中心，北京 100097

動物及獸醫生物技術

抗重金屬汞離子抗體的制備及鑒定

趙麗1,2，王鳳龍1，楊慧2，李鵬2，劉滿杏2，李霞2,3

1 內蒙古農業大學動物科學與醫學學院，呼和浩特 010018

2 北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097

3 北京農產品質量檢測與農田環境監測技術研究中心，北京 100097

汞、鎘、鉛等重金屬引起的環境污染已在世界范圍內造成危害。快速、廉價地監測生境中重金屬是減小其對人類及動物危害的先決條件。傳統檢測方法無法滿足高通量的現場檢測，建立更快速、更經濟的免疫分析法檢測汞離子是生產及經濟發展的需要。本研究中，報道了汞特異性單克隆抗體的制備與篩選方法和結果。因 Hg2+太小以至于不能引起免疫反應，所以用螯合劑 (二乙烯三胺五乙酸，DTPA) 將金屬離子與載體蛋白 (匙孔血藍蛋白，KLH) 連接起來。成功合成、鑒定汞復合物抗原后，免疫 BALB/c小鼠，通過細胞融合獲得了穩定分泌抗體的雜交瘤細胞。用極限稀釋法亞克隆，通過ELISA篩選，獲得了2株穩定分泌抗汞離子抗體的細胞株 (H2H5，H1H8)。小鼠腹腔注射1×107H2H5、H1H8細胞株制備腹水，腹水抗體效價都在1∶51 200以上。經鑒定兩株雜交瘤均為IgG1亞類，輕鏈為kappa型且分泌抗體穩定性較好。實驗結果為汞離子殘留免疫學檢測方法的建立提供了技術基礎，對提高風險評估工作的效率和質量，保障食品安全有重要現實意義。

汞，螯合抗原，單克隆抗體，酶聯免疫吸附法

Abstract:The environmental pollution by heavy metals such as mercury, cadmium and lead has become a worldwide public health hazard. To rapidly and inexpensively monitor environmental heavy metals is a prerequisite for minimizing human and animal exposure. The development of immunoassays to detect mercury ion residues has been a promising trend with the advantage of rapid and cheap operation. We reported the isolation and characterization of mercury-specific monoclonal antibodies. Because Hg2+ions are too small to elicit an immune response, the metal was coupled to protein carrier (keyhole limpet, KLH) using a chelator (diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA). After the synthesis of antigen and characterization,monoclonal antibodies against mercury ions were generated by immunizing BALB/c mice with mercury conjugated antigen(Hg-DTPA-KLH). The stable hybridoma cell lines were produced by fusion of murine splenocytes and SP2/0 myeloma cells.The hybridoma cells were subcloned by the limiting dilution and screened by ELISA, two hybridoma cell lines producing stably specific monoclonal antibodies (MAbs) against mercury ions were obtained, named H2H5 and H1H8. The ascites fluid was produced in BABL/c mice by intraperitoneal injection of 1×107H2H5 and H1H8 cells, respectively. The titers of ascites were all above 1:51 200. The isotyping of secrete antibodies from two hybridoma cell lines was IgG1,kappatype. These data laid a potency of establishing immunoassays methods of determining Hg2+ion residues and had the realistic significance for improving the efficiency and quality of risk assessment.

Keywords:mercury, chelated antigen, monoclonal antibody, ELISA

近年來，重金屬污染事件層出不窮、愈演愈烈，人類賴以生存的空氣、土壤、蔬菜和動物均受到了重金屬等毒物的污染。環境污染和飼料藥物添加劑的濫用，造成畜禽產品重金屬殘留不同程度超標[1]。作物中積累的重金屬離子通過食物鏈的生物放大作用進入人畜體內，威脅人畜健康[2]。汞是蓄積作用較強的元素，主要在動物體內蓄積。湖泊、沼澤中的水生植物、水產品易蓄積大量的汞。上世紀50年代后期，農業上使用含汞殺螨劑以來，汞對土壤、自然水系和大氣的污染日益嚴重。汞污染在世界的某些地區已成為大眾健康的公害[3]。快速靈敏地檢測食物中的重金屬含量是保障食品安全的基礎，傳統檢測重金屬殘留的分析方法包括原子吸收光譜分析(Atomic absorption spectroscopy，AAS) 和電感耦合等離子發射光譜 (Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES) 等[4]是靈敏、可靠的，但昂貴的儀器、專業的分析人員及復雜的樣品前處理限制了這些方法的應用。檢測必須在具備大型分析儀器的重點實驗室內進行，無法用于現場檢測，而且受到費用高、處理量有限和檢測時間長等限制[5]。傳統的重金屬檢測方法不適合蔬菜、水果等保鮮期短、利潤低和需大通量檢測的樣品。

國外對重金屬免疫檢測技術以重金屬螯合物特異性單克隆抗體識別重金屬或重金屬螯合劑抗原為基礎，建立快速檢測方法已經有一定的研究成果[6]。本研究室利用單克隆抗體技術，研究和建立重金屬的免疫學檢測方法。并利用其快速、廉價、靈敏和特異性強的優點，將該方法發展成便于現場檢測的便攜方法，從而適用于農畜產品的抽樣檢測及進出口通關的快速檢驗[7]。對提高風險評估工作的效率和質量，保障食品安全有重要現實意義。本研究報告了金屬汞離子螯合物的單克隆抗體的獲得、鑒定方法和結果，為汞離子殘留免疫學檢測方法的建立打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

汞離子 (Hg2+)、匙孔血藍蛋白 (KLH)、卵清蛋白 (OVA)、牛血清白蛋白 (BSA)、佐劑 (FCA、FICA)、聚乙二醇 (PEG)、8-氮鳥嘌呤 (8-AG) (美國Sigma 公司)；螯合劑 DTPA (日本 DOJINDO)；DMEM高糖基礎培養基、臺盼藍 (北京索來寶科技有限公司)；四甲基聯苯胺 (TMB) (天根生化科技 (北京)有限公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG(IgG-HRP)、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgM(IgM-HRP) (北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗體亞型鑒定試劑盒、Tween-20 (瑞士 Roche公司)；HEPES (北京華美生物工程公司)；胎牛血清 (FBS)(杭州四季青公司)；BCA蛋白質濃度檢測試劑盒 (美國Novagen公司)。

1.1.2實驗動物

BALB/c小鼠 (雌性，6周齡)，購于中國軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.3細胞

SP2/0小鼠骨髓瘤細胞，哈爾濱獸醫研究所王雪峰贈送。

1.1.4儀器及其他

可調微量加樣器 (法國Gilson公司)；酶聯免疫分析儀 (美國 Bio-Rad公司)；全自動洗板機 (美國AWARENESS Technology公司)；磁力攪拌器 (北京金輝盛業科技有限公司)；純水系統、CentriconYM-30超濾管 (美國Millipore公司)；聚苯乙烯酶聯反應板、24孔、96孔細胞培養板、細胞培養瓶 (美國Corning/Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1抗原的制備與鑒定

Hg-DTPA-KLH：取5.65 mg DTPA加入1 mL HEPES緩沖液 (pH 9.73) 中形成A液，轉入反應器，再加入濃度為3.46 mol/L的Hg(NO3)210 μL，室溫下反應 30 min后同時加入 0.4 mL HEPES緩沖液(pH 9.73) 和1.7 mL濃度為5.9 g/L的KLH，調節pH至9.0，室溫下攪拌反應12 h。偶聯反應后，用預處理的CentriconYM-30超濾管對蛋白質復合物進行分離純化，除去沒有參與反應的 Hg2+、螯合劑DTPA和Hg-DTPA復合物。

Hg-DTPA-OVA的合成方法同上，DTPA-OVA的合成方法同上用超純水代替金屬離子即可。超濾后用BCA試劑盒測定復合物蛋白濃度[8]。參照國標GB/T 17141-1997，用石墨爐原子吸收光譜法檢測超濾后的上清、濾過液及HEPES液中Hg2+濃度[9]。

1.2.2小鼠的免疫及融合小鼠的選擇

小鼠的免疫：首免時，免疫抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后乳化1～2 h[10]，每只BABL/c小鼠皮下多點注射200 μg抗原。3周后第2次免疫，相同劑量抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后免疫，以后每隔2周免疫1次，方法同第2次免疫。第3次免疫及以后每次免疫后7 d，尾靜脈采血，分離血清，測定血清的效價和產生抗體的特異性。

融合小鼠的選擇：用間接ELISA法選擇融合小鼠，方法如下：1) 包被：用HBS (10 mmol/L，pH 7.4)稀釋Hg- DTPA-OVA和DTPA-OVA，并以相同的濃度 5 mg/L分別包被到96孔酶標板上，50 μL/孔，4℃過夜或37℃孵化2 h；2) 封閉：PBST洗滌5次，拍干，按 100 μL/孔加入 3% BSA，37℃封閉 1 h；3) 一抗：洗滌同上，加入相同的待檢血清，以未免疫小鼠的血清作陰性對照，50 μL/孔，37℃孵化1 h；4) 酶標二抗：洗滌同上，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG/IgM (混合物) 1∶5 000 稀釋后，50 μL/孔，37℃孵育1 h；5) 顯色：洗滌同上，加入顯色液TMB，50 μL/孔，37℃孵育 15 min；6) 終止反應：按50 μL/孔加1 mol/L鹽酸終止反應；7) 酶標儀上測OD450值，以空白孔調零。按公式計算差異率Differnce%= (OD450of Hg-DTPA-OVA?OD450of DTPA-OVA)/OD450of DTPA-OVA×100%。

1.2.3細胞融合

融合前3 d加強免疫小鼠。融合前1 d制備飼養細胞，將細胞濃度調至1×105/mL，按0.1 mL/孔加到96孔細胞培養板內，備用。取小鼠脾臟及處于對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞株以6∶1數量比混合，用 50% PEG介導融合，將融合后的細胞加入到含飼養細胞的培養板中，0.1 mL/孔，37℃、5%CO2培養箱培養[11]。

1.2.4陽性融合孔的篩選及陽性融合細胞的克隆

待細胞長滿孔底的 1/3后，檢測融合孔上清，方法同1.2.2中融合小鼠的選擇，一抗是細胞上清，用未融合孔作陰性對照。用極限稀釋法克隆陽性細胞，細胞上清的檢測方法同陽性融合孔的篩選。

1.2.5雜交瘤染色體核型的鑒定[12]

取對數生長期雜交瘤細胞株H1H8和H2H5，用終濃度為0.05～0.1 mg/L的秋水仙素處理4～6 h，收集細胞后用低滲KCl溶液處理30 min，固定液固定，滴加細胞懸液到4℃預冷的載玻片上，室溫自然干燥，Giemsa染色，經光學顯微鏡觀察，挑選細胞形態完整染色體分散均勻的細胞計數。每株計數 5個細胞，記錄染色體數目并算出平均值。

1.2.6腹水型單克隆抗體的制備

取8～10周齡的雌性BABL/c小鼠，腹腔注射石蠟油 (0.5 mL/只)，1～2周后分別腹腔注射1×106個雜交瘤H2H5和HIH8，接種細胞7～10 d后密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，抽取腹水。室溫放置30 min后，4℃放置1.5～2 h后，12 000 r/min離心2 min，取上清?20℃保存備檢。梯度稀釋腹水型抗體后檢測小鼠腹水效價，檢測方法同1.2.2中融合小鼠的選擇，一抗是稀釋后的腹水。

1.2.7抗汞離子抗體亞型的鑒定

取出正在培養的雜交瘤 H2H5和 HIH8細胞上清，按 1∶50稀釋后，按照鼠單抗亞型鑒定試劑盒ISOStripTM Monoclonal Antibody Isotyping Kit說明書操作，取稀釋液0.15 mL加入試劑盒小管中，室溫放置1 min。待其自然溶解后，輕輕混勻。然后將試劑條插到小管底部，大約5 min后，當最前端條帶在兩對“+”中間出現時，即可見與雜交瘤細胞株所分泌的抗體亞類和輕鏈類型對應的指示條帶所在位置，從而確定抗體亞型。

1.2.8雜交瘤分泌抗體穩定性的測定

將雜交瘤細胞株凍存后，過一段時間再復蘇并且連續培養后測抗體效價。檢測方法同陽性融合孔的篩選，用 Hg-DTPA-OVA包被酶標板，二抗用辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG。

2 結果

2.1 抗原的制備與鑒定

超濾后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，繪制標準曲線后，據公式y=0.0008x+0.0065(R2=0.9995) (y表示OD570，x表示蛋白濃度 (mg/L)) 計算出上清中完全抗原Hg-DTPA-KLH蛋白濃度為4.615 g/L，濾過液中蛋白濃度為0.01 g/L。

用石墨爐原子吸收光譜法檢測 Hg2+結果：Hg-DTPA-KLH、DTPA-KLH、HEPES溶液中汞離子的濃度分別為208 mg/kg、0 mg/kg、0 mg/kg。如果抗原未合成成功，游離的 Hg2+或 Hg-DTPA會隨著超濾而被過濾掉，超濾后的上清中不會含有Hg2+，而我們從超濾后的上清中檢測出了 Hg2+且含量較高，證明抗原合成成功。

2.2 融合小鼠的選擇

五免后檢測小鼠血清中抗體效價后，計算各小鼠的差異率的結果顯示 1號小鼠差異率最高。幾只小鼠同時產生了抗DTPA和Hg-DTPA的抗體，但是1號小鼠抗 Hg-DTPA的抗體水平最高且差異率最大，說明1號小鼠產生針對Hg2+的抗體特異性最強，所以選1號小鼠用于融合 (圖1)。

2.3 細胞融合及陽性融合孔的篩選

10 d后96孔細胞培養板中長出肉眼可見的雜交瘤細胞團，待細胞長滿孔底的 1/3時取細胞上清檢測抗體效價，結果顯示雜交瘤H2H5、3D12、H1H8、2A11抗體效價都大于陰性對照的2.1倍，判定為陽性雜交瘤，且H2H5、H1H8的差異率比2A11、3D12的差異率大，4株細胞上清與 Hg-DTPA-OVA反應OD450值均高于與 DTPA-OVA反應OD450值，其中H1H8、H2H5差異較大 (圖2)，說明這 2株細胞分泌的抗體針對 Hg2+離子的特異性較強，選 H1H8、H2H5進行亞克隆。

圖1 小鼠五免后的差異率Fig.1 Difference rate of the fifth immunized mice.

圖2 陽性雜交瘤細胞的篩選Fig.2 Selection of the positive hybridomas.

2.4 陽性融合細胞的亞克隆化

H1H8和H2H5經過2次亞克隆化后分泌的抗體效價有所升高，成功獲得穩定的分泌抗Hg2+單克隆抗體的細胞株，還可以看出 H2H5分泌的抗體對金屬Hg2+的特異性較H1H8的強 (圖3)。

圖3 H1H8和H2H5第二次克隆后細胞上清抗體效價Fig.3 Supernatant titer of hybridoma H1H8 and H2H5 after the second cloning.

2.5 雜交瘤細胞染色體核型分析

SP2/0細胞的染色體數目平均為68條，脾細胞染色體數目平均為40條，而雜交瘤細胞的染色體數目均在100以上，高于2個親本細胞的染色體數目，說明這2株雜交瘤細胞是 SP2/0細胞和脾細胞的雜交產物。

2.6 腹水型單克隆抗體的制備

取得細胞株 H1H8和 H2H5腹水型抗體后檢測得出H1H8小鼠腹水效價可達1∶51 200，而 H2H5的效價大于1∶51 200 (圖4)。

2.7 抗汞離子抗體Ig類和亞類的鑒定

當最前端條帶出現在兩對“+”中間時，抗體亞類和輕鏈指示條帶分別在 G1、k位置，即細胞株HIH8和H2H5所分泌的抗體均為IgG1亞類，輕鏈為kappa型 (圖 5)。

2.8 雜交瘤分泌抗體穩定性的測定

圖4 H1H8和H2H5腹水型單克隆抗體的檢測Fig.4 Titer of ascites of H1H8 and H2H5.

圖5 H1H8和和H2H5分泌抗體亞型Fig.5 Isotyping of H1H8 and H2H5 secrete antibody.

圖6 H1H8和H2H5分泌抗體的穩定性Fig.6 Stability of H1H8 and H2H5 secrete antibody.

經檢測顯示細胞株 H2H5和 H1H8分泌抗金屬Hg2+單克隆抗體的水平未見明顯下降 (圖6)，表明抗體的穩定性較好，同時可證明亞克隆較成功。效價稍有波動，可能是由于取細胞上清備檢時間間隔不同以及每次檢測之間的誤差所致，屬正常。

3 討論

對重金屬的常規性檢測方法已經有很多種，有些也已經是非常成熟的技術，但因為重金屬離子存在的范圍很廣，根據檢測精度、方便程度和檢測成本，每種技術都有其局限性，同時還需合適的場所，因此都不利于在生產中推廣應用。本研究所用的免疫學檢測技術具有檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等優點，可用于現場對重金屬進行靈敏、準確、實時、快速的檢驗分析。免疫分析技術引起人們越來越多的關注，這也是免疫分析技術發展的必然趨勢，也是成本低工業化生產所要求的。

由于 Hg2+能與動物體內生物分子發生強烈的不可逆的反應，導致動物中毒，因此，可利用特異性的雙功能螯合劑DTPA螯合Hg2+，形成能被動物免疫系統識別的螯合物，但這些重金屬復合物是分子量低于1 kDa的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反應[13]。DTPA除了能螯合金屬離子之外，還能與載體蛋白偶聯，可以成功制備重金屬汞的包被抗原和免疫抗原[14-15]。有多種蛋白質如KLH、BSA、OVA等能作為載體蛋白，但從誘發免疫應答的角度來看，KLH的免疫原性優于 BSA、OVA等，因此本研究用 KLH作為載體蛋白來免疫小鼠以期產生更強的免疫應答。

重金屬 Hg2+單克隆抗體制備的關鍵在于重金屬免疫原的制備，所以對免疫原鑒定后再免疫小鼠是成功得到重金屬單克隆抗體的保證。本研究先用BCA法測定了超濾后上清中的重金屬復合物蛋白濃度，然后用石墨爐原子吸收光譜法檢測其中的Hg2+含量，這為之后重金屬Hg2+的單克隆抗體的成功制備提供了可靠的保證。

本研究根據差異率篩選融合所用小鼠，差異率越大說明產生針對Hg2+的抗體特異性越強，融合篩選得到陽性雜交瘤細胞的幾率就越大。

本研究成功獲得了抗重金屬 Hg2+或 Hg-DTPA的單克隆抗體，目前正在純化抗體并對抗體的各項性能進行鑒定。該工作的完成為其他抗重金屬抗體的制備提供了可行的方法，也為重金屬免疫檢測方法的建立及應用 (如ELISA方法、免疫膠體金快速診斷法[16]等) 奠定了基礎。

REFERENCES

[1] Pang RY. Livestock and poultry products quality safety problems and countermeasures in China.J Heilj Grain,2007(4): 20?22.

逄瑞玥. 我國畜禽產品質量安全存在的問題及應對策略. 黑龍江糧食, 2007(4): 20?22.

[2] Lang ML, Zhang YX, Chai TY. Advances in the research of genetic engineering of heavy metal resistance and accumulation in plants.Chin J Biotech, 2004, 20(2):157?164.

郎明林, 張玉秀, 柴團耀. 基因工程改良植物重金屬抗性與富集能力的研究進展. 生物工程學報, 2004, 20(2):157?164.

[3] Mei GQ. Harmfulness and treatment of heavy metal waste water.Stud Trace Elem Health, 2004, 21(4): 54?56.

梅光泉. 重金屬廢水的危害及治理. 微量元素與健康研究, 2004, 21(4): 54?56.

[4] Bontidean I, Lloyd JR, Hobman JL,et al. Bacterial metal-resistance proteins and their use in biosensors for the detection of bioavailable heavy metals. J Inorg Biochemy, 2000, 79(1/4): 225?229.

[5] Liu GL, Wang JF , Li ZY,et al. Advances in heavy metal ions immunoassay.Chin J Biotech, 2006, 22(6): 877?881.

劉功良, 王菊芳, 李志勇, 等. 重金屬離子的免疫檢測研究進展. 生物工程學報, 2006, 22(6): 877?881.

[6] Blake DA, Jones RM, BlakeⅡ RC. Antibody -based sensors for heavy metal ions.Biosens Bioelectron, 2001,16(9-12): 799?809.

[7] Blake RC, Delehanty JB, Khosraviani M. Allosteric binding properties of a monoclonal antibody and its fab fragment.Biochemistry, 2003, 42(2): 497?508.

[8] Robert C, Blake II, Andrey R,et al. Novel monoclonal antibodies with specificity for chelated uranium(VI):isolation and binding properties.Bioconjugate Chem,2004, 15(5): 1125?1136.

[9] Khosraviani M, Pavlov AR, Flowers GC,et al. Detection of heavy metals by immunoassay: optimization and validation of a rapid, portable assay for ionic cadmium.Environ Sci Technol, 1998, 32(1): 137?142.

[10] Palmarini M, Murgia C, Fan H. Spliced and prematurely polyadenylated Jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)-specific RNAs from infected or transfected cells.Virology, 2002,294(1): 180?188.

[11] Li FK, Wang CY. Experimental Animals and Animal Experiments Methodology. Zhengzhou: Zhengzhou University Press, 2007: 377.

李鳳奎, 王純耀主編. 實驗動物與動物實驗方法學. 鄭州: 鄭州大學出版社, 2007: 377.

[12] Situ ZQ. Cell Culture. Xi′an: World Books Publishing House, 2007: 242.

司徒鎮強主編. 細胞培養. 西安: 世界圖書出版社,2007: 242.

[13] Yu HN, Jones RM, Blake DA. An immunosensor for autonomous in-line detection of heavy metals: validation.Int J Environ Anal Chem, 2005, 85(12/13): 817?830.

[14] Darwish IA, Blake DA. One-step competitive immunoassay for cadmium ions: development and validation for enviromental water samples.Anal Chem,2001, 73(8): 1889?1895.

[15] Darwish IA, Blake DA. Development and validation of a one-step immunoassay for determination of cadmium in human serum.Anal Chem, 2002, 74(1): 52?58.

[16] Chen FM, Li J, Qu YJ,et al. Application and research progress of the immune colloidal gold technique.Chin J Veter Drug, 2004, 38(8): 33?35.

陳鳳梅, 李娟, 曲原君, 等. 免疫膠體金的研究進展及應用. 中國獸藥雜志, 2004, 38(8): 33?35.

Preparation and characterization of specific monoclonal antibodies against mercury ions

Li Zhao1,2, Fenglong Wang1, Hui Yang2, Peng Li2, Manxing Liu2, and Xia Li2,3

1College of Animal Science and Medicine, Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot010018,China
2Vegetable Research Center of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing100097,China
3Beijing Research Center for Agri-food Testing and Farmland Monitoring,Beijing100097,China

Received:December 29, 2009;Accepted:April 7, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z439), National Natural Science Foundation of China (No. 30671205), Project of Beijing Municipal Science & Technology Commission (No. Z09090501040901).

Corresponding author:Xia Li. Tel: +86-10-51503069; E-mail: lixia@nercv.org

國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2007AA10Z439)，國家自然科學基金 (No. 30671205)，北京市科委課題 (No. Z09090501040901)資助。