西維來斯他對油酸-內毒素介導大鼠ALI/ARDS的肺保護作用

蔡振剛,董晨明

(蘭州大學:1.第二臨床醫學院 730000;2.第二醫院重癥醫學科 730010)

Ashbaugh首次報道急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)后世界各國對ARDS的研究逐步深入,但其病死率仍高達35%～50%[1-4]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和ARDS是嚴重創傷或感染后出現最早、發病率最高的并發癥,也是直接導致患者死亡的主要原因[5]。ARDS是各種炎癥因子間的相互作用,引起中性粒細胞的活化和血管內皮細胞黏附分子表達,中性粒細胞聚集臟器并釋放彈性蛋白酶是引起肺損傷的主要原因之一。西維來斯他是一種彈性蛋白酶抑制劑,能夠選擇性地抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶。本研究中采用油酸-內毒素貫序靜脈注射制備大鼠ALI/ARDS模型,觀察西維來斯他持續靜脈泵注對ALI/ARDS大鼠中性粒細胞彈性蛋白酶、髓系細胞觸發受體-1的影響,闡明西維來斯他在ALI/ARDS的肺保護作用,以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 SPF級SD大鼠48只,雌雄各半,體質量190～215 g,購自甘肅省中醫學院實驗動物中心。制備大鼠ALI/ARDS模型,將大鼠稱重、編號,禁食 6 h,禁飲水4 h。以巴比妥鈉注射液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后固定,常規消毒,鋪無菌洞巾。在大鼠左股部內側作一長約1 cm的切口,暴露股靜脈并分離,避免損傷股動脈及股神經。用5號針頭穿刺入股靜脈固定以備輸液?？瞻讓φ战M僅給予等量生理鹽水注入。其余3組均以油酸0.2 m L/kg尾靜脈推注,2 h后用內毒素以2 mg/kg尾靜脈推注。

1.2 動物分組及給藥 將48只大鼠按隨機數字表法分為空白對照組(n=12)、模型對照組(n=12)、預處理組(n=12)和后處理組(n=12)?？瞻讓φ战M、模型對照組僅給予等量生理鹽水以微量泵泵注。預處理組在制備動物模型的同時給予西維來斯他5 mg?kg-1?h-1泵注,后處理組在制備動物模型后2 h給予西維來斯他5 mg?kg-1?h-1泵注。

1.3 標本采集與處理 在各組動物制備模型6 h后股動脈采血留取4 mL于普通試管中,25℃、2 000 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min,分離血清,-20℃保存待檢。用靜脈留置針插入氣管反復用生理鹽水行右肺支氣管肺泡灌洗,每次灌洗2 mL,反復3次,收集灌洗液,記錄回收量,并保證回收率在70%以上。灌注液以2 000 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min,取上清液測定。嚴格無菌留取左肺組織,10%甲醛固定,病理切片后用HE染色。

表1 西維來斯他對ALI/ARDS大鼠血清中性粒細胞彈性蛋白酶和BALF-NE水平的影響(±s,n=12)

表1 西維來斯他對ALI/ARDS大鼠血清中性粒細胞彈性蛋白酶和BALF-NE水平的影響(±s,n=12)

與空白對照組比較,*:P＜0.01;與模型對照組比較,Δ:P＜0.01;與后處理組比較,#:P＜0.05。

檢測指標 空白對照組 模型對照組 預處理組 后處理組血漿NE(ng/L) 32.476±3.280 43.212±1.682 36.796±2.393*Δ# 38.899±2.230*Δ BALF-NE(ng/L) 35.388±3.280 50.703±2.183 40.955±3.894*Δ# 45.639±4.459*Δ

表2 西維來斯他對ALI/ARDS大鼠肺干/濕重比、BALF TREM-1中性粒細胞計數水平和BALF的影響(±s,n=12)

表2 西維來斯他對ALI/ARDS大鼠肺干/濕重比、BALF TREM-1中性粒細胞計數水平和BALF的影響(±s,n=12)

與空白對照組比較,*:P＜0.01;與模型對照組比較,Δ:P＜0.01;與后處理組比較,#:P＜0.05。

檢測指標 空白對照組 模型對照組 預處理組 后處理組肺干/濕重比 4.087±0.379 5.333±0.410 5.010±0.368*Δ# 4.712±0.304*Δ TREM-1(ng/L) 35.065±2.797 43.704±3.996 37.611±2.233*Δ# 39.889±2.633*Δ中性粒細胞計數(×105/L) 3.045±0.298 42.983±3.342 24.248±2.264*Δ# 17.769±1.803*Δ

1.4 檢測指標及方法 (1)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細胞計數:將0.1 mL的BALF加入血細胞計數板計數細胞總數。(2)中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓系細胞觸發受體-1(triggering receptor expressedon myeloid cells-1,TREM-1)測定:在各時間點斷尾采血,以2 000 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min,取上清液測定。(3)支氣管肺泡灌洗液的中性粒細胞彈性蛋白酶的水平測定:用無菌生理鹽水2 mL灌注右肺,反復沖洗,回吸量大于注入量的70%,灌注液以2 000 r/min(離心半徑20 cm)離心10 min,取上清液測定。(4)肺組織的干濕比重測定:每組每只大鼠稱取約0.25 g左側濕肺組織,用濾紙吸凈表面血跡后準確稱取其質量,用電熱恒溫干燥箱80℃下烘干,48 h后稱干重,按公式計算肺干/濕重比。

1.5 病理學觀察 取相同部位左側肺組織10%甲醛固定1周,梯度乙醇脫水,切取相同部位肺組織制成標本,常規切片,石蠟包埋,蘇木素-伊紅染色,光學顯微鏡下觀察肺組織肺形態學病理改變。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件,所有計量數據均以±s表示,各實驗組間的兩兩比較采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ALI大鼠的BALF中性粒細胞彈性蛋白酶的水平和中性粒細胞計數的變化及西維來斯他治療的影響 與模型對照組比較,預處理組和后處理組的BALF中性粒細胞彈性蛋白酶水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01)。與后處理組比較,預處理組BALF中性粒細胞彈性蛋白酶水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05),見表 1。

2.2 ALI大鼠血漿中性粒細胞彈性蛋白酶和TREM-1的變化及西維來斯他治療的影響 與模型對照組比較,預處理組和后處理組的血清中性粒細胞彈性蛋白酶水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01),血清 TREM-1的水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01)。與后處理組比較,預處理組血清中性粒細胞彈性蛋白酶水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05),血清TREM-1的水平明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05),見表 2。

圖1 正常對照組肺組織6 h病理變化(HE染色,×200)

圖2 模型對照組肺組織6 h病理變化(HE染色,×200)

圖3 預處理組肺組織6 h病理變化(HE染色,×200)

2.3 ALI大鼠肺組織病理變化及西維來斯他治療的影響見圖1～4。

圖4 后處理組肺組織6 h病理變化(HE染色,×200)

3 討 論

ALI是指嚴重感染、創傷等打擊后,出現以彌漫性肺泡毛細血管膜損傷導致肺水腫和微肺不張為病理特征,臨床表現為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥,嚴重者即為ARDS[6]。目前ALI和ARDS患者的病死率仍然很高。本研究采用油酸和內毒素貫序注射旨在模擬臨床嚴重創傷合并感染時肺損傷的演進過程。油酸靜脈注射后形成ARDS的機制是首先引起肺毛細血管脂肪栓塞,造成血管內皮損傷,進而引起肺泡毛細血管膜的通透性增加,肺間質和肺泡損傷[7]。靜脈注射內毒素相當于嚴重革蘭陰性菌釋放內毒素入血。已經證實A LI的機制:(1)由于內毒素的直接損傷;(2)機體釋放大量的炎性細胞及遞質(如TNF-α、IL-1β、IL-8等)使機體的抗炎與促炎平衡破壞,引發肺臟的過度炎癥反應,造成肺組織的急性損傷。

本研究結果顯示,模型對照組動物血清和BALF中NE含量增高,說明油酸可導致肺泡毛細血管的脂肪栓塞,加重血管內皮細胞的破壞,使各種炎性細胞滲出,內毒素刺激機體后,激活免疫細胞和炎性細胞釋放大量炎癥介質和細胞因子,中性粒細胞激活釋放大量的NE,使血清NE升高。模型對照組、預處理組和后處理組比較,預處理組和后處理組血清NE增加的幅度明顯低于模型對照組(P＜0.01),提示西維來斯他能有效地抑制NE的生成及活性,減輕肺組織損傷。預處理組和后處理組比較,預處理組血清NE增加的幅度明顯低于后處理組(P＜0.05)。后處理組和預處理組比較,后處理組BALF中性粒細胞增加的幅度明顯低于預處理組(P＜0.05)。中性粒細胞彈性蛋白酶活性增加所導致的蛋白減少會破壞細胞表面和基膜的完整性,致使肺泡的通透性增加[8]。另外,這些中性粒細胞彈性蛋白酶的基質降解的作用與中性粒細胞移位[9]和趨化性肽的產物包括白介素-8有關。NE可分解血管基膜和間質,增強肺組織ICAM-1的表達,使中性粒細胞與內皮細胞之間的黏附更加牢固而進一步激活中性粒細胞,形成一種惡性循環,加重肺損傷。西維來斯他是小分子NE抑制劑,能可逆性且競爭性抑制NE。西維來斯他的保護作用在很大程度上是歸功于其特別的抑制作用。它可以進入微環境并對氧化物酶具有特殊的抵抗作用。西維來斯他也能減弱BALF中炎癥細胞浸潤。這種中性粒細胞漏出至肺泡的減弱已經在病理切片中得到證實,NE抑制劑的有益作用對中性粒細胞浸潤的改善不僅在ALI,也在缺血再灌注的炎癥模型中得到證實。這種結果提示中性粒細胞漏出的媒介,也是減少中性粒細胞介導的毒性媒介。本研究表明不同時機應用西維來斯他可能會對 ALI/ARDS有不同的影響。研究表明早期應用NE抑制劑可能有效。NE是在本質上決定著ALI/ARDS危急進展的預測因素或者征兆。預測因素可能是 NE臨界水平,它決定著某些ALI/ARDS患者進展。延遲性的應用NE抑制劑西維來司他在ALI出現后的肺泡水腫和中性粒細胞漏出有一定的防止作用。

TREM-1是一種新型的炎癥激發受體,其主要表達在中性粒細胞及單核細胞膜表面。它的天然配體目前還不明確,其表達主要受細菌、真菌及細菌代謝產物脂多糖(LPS)上調。通過激活中性粒細胞及單核細胞引起白介素-8(IL-8)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥前化學增活素的分泌,從而在炎癥反應中發揮重要的作用[10]。TREM-1廣泛表達于皮膚、淋巴結、肺組織中,在血嗜中性白細胞、CD14+單核/巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、肉芽腫及周圍的單核細胞源性的上皮樣細胞上高表達,在非感染性炎癥如分支桿菌屬結核菌或異質體肉芽腫引起的肉芽腫感染中很少或不表達[11]。TREM-1的細胞和組織分布特點提示其在抗感染炎癥反應中起作用。TREM-1有促進炎性因子分泌的作用[12],能誘導中性粒細胞和單核細胞分泌 TNF-α、IL-1β、IFN-γ等促炎因子,中性粒細胞趨化因子 IL-8,單核細胞趨化因子MCP-1和MCP-3,活化單核細胞表面的CD40、CD86和CD54等共刺激分子,還能誘導中性粒細胞釋放髓過氧化物酶。TREM-1在膿毒血癥等急性炎癥反應中具有重要的作用,在人的炎癥組織及腹腔液中局部浸潤的中性粒細胞、巨噬細胞表面的TREM-1均處于高水平表達。它介導的信號傳導通路在炎癥反應的發生和級聯放大中起重要作用。本研究結果顯示,模型對照組、預處理組和后處理組比較,預處理組和后處理血清TREM-1增加的幅度明顯低于模型對照組(P＜0.01)。預處理組和后處理組兩組比較,預處理組血清TREM-1增加的幅度明顯低于后處理組(P＜0.05)。西維來斯他降低ALI時BALF中的TREM-1的水平,其直接機制尚未清楚。其機制可能為TREM-1激活后,可上調其下游的 TNF-α、IL-1β、GM-CSF等細胞因子的表達,并抑制抗炎癥反應因子白介素-10(IL-10)的表達;同時,它激活的這些下游的細胞因子又能正反饋地上調其表達。這樣,TREM-1與這些下游細胞因子之間形成一個正反饋的自分泌調節回路,促使炎癥反應增強、放大[13-14]。TREM-1與ALI之間的關系尚需進一步的研究。

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