聯合檢測外周血AFPmRNA、h-TERT mRNA對肝細胞肝癌的診斷價值*

張利國,周 杰,林建華,張 興

(1.南方醫科大學附屬南方醫院肝膽外科,廣州510515;2.河南省魯山縣人民醫院 467300)

肝細胞肝癌是一種嚴重危害人類生命健康的惡性腫瘤。其發病率居高不下,早期發現、早期診斷、早期治療可以提高患者的生存率,改善其預后[1]。而對肝腫瘤的早期診斷,目前采用的B超、CT掃描等手段通常難以實現;檢測AFP可以作為腫瘤標志物用于肝癌人群篩檢,但其陽性率和特異性較低,結果不夠理想,因而使用新的、更為敏感的肝癌標志物就顯得非常的必要。作者應用靈敏的熒光定量PCR技術分析肝細胞肝癌患者外周血中AFP mRNA、h-TERT m RNA的表達量作為腫瘤標志物,達到對肝細胞肝癌的早期診斷,為臨床早期診斷提供更為合理的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 南方醫科大學附屬南方醫院肝膽外科2008年1～11月收治的肝癌患者,術前經影像學、血清AFP檢測以及臨床資料證實為原發性肝癌,并行肝癌切除手術治療,術后經病理證實為肝細胞癌患者60例,其中男38例,女22例,患者平均年齡(51.2±10.4)歲;血清 AFP陽性(AFP≥200μg/L)40例(66.7%);腫瘤直徑大于或等于 5 cm者 36例(60%);肉眼及鏡下門靜脈癌栓14例(23.3%);肝內轉移者16例(26.7%);肝外轉移者8例(13.3%);腫瘤細胞分化程度高、中、低度者分別為 20例(33.3%)、28例(46.7%)、12例(20%)。對照組為35例肝外良性病變者或健康人。

1.2 標本采集 所有對象均于清晨空腹采集外周靜脈血5 mL,應用含EDTA的抗凝劑抗凝。靜脈血采集后立即提取總RNA。

1.3 總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA的提取按TRIZOL(invitrogen)說明書進行操作。總RNA提取后即進行cDNA合成,反應體系包括:(1)5×緩沖液4μL;(2)dNTP(10 mM)1μL;(3)隨機引物(50 uM)1μL;(4)RNasin(40 u/μL)1μL;(5)M-MLV(200 u/μL)1μL;(6)總 RNA 1～2μg;(7)加DEPC處理的三蒸水至20μL。在全自動PCR儀按照說明設定參數,產物置于-20℃冰箱備用。

1.4 熒光定量 PCR檢測AFP mRNA、h-TERT mRNA方法的建立

表1 AFP mRNA和h-TERT mRNA在肝癌和對照組的相對表達量

1.4.1 引物的設計、合成 從GenBank中調出 AFP和h-TERT的 RNA序列,根據引物設計原則,利用Primer Premier 5.0軟件設計引物,跨內含子序列。AFP上游引物:5′-AGA TAG CAA GAA GGC ATC CCT T-3′;下游引物:5′-CCT TTG TTT GGA AGC ATT CAA CTG 3′;h-TERT上游引物:5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′;下游引物:5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′;GAPDH上游引物:5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA TG-3′;下游引物:5′-CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC T-3′;引物由上海英駿公司合成。

1.4.2 FQ-PCR定量分析 用real-time PCR儀(Bio-Rad公司)及SYBRGreenⅠ(北京百泰克公司)試劑,進行熒光定量分析AFP mRNA 、h-TERT mRNA含量,并用GAPDH作為參照正常化校正。分別用AFP、h-TERT的cDNA樣品和GADPH樣品倍比稀釋做標準曲線,呈現良好的線性關系,r2分別是0.999、0.998和0.999。樣品管均外加 2個復管,結果取其均值,另設空白和陰性對照管。FQ-PCR反應條件:93℃預變性2 min,93℃45 s,55℃120 s,共 45個循環,反應結束后熒光定量儀自動給出相關的結果和曲線。

1.5 統計學方法 以ΔCt為差異比較的基礎,相對定量公式為 2-ΔΔCt;其中 ΔΔCt=ΔCt(未知樣品)-ΔCt(內參),結果為倍數關系。Ct值反映了模板擴增到一定量拷貝數時(處于指數上升期)所需反應循環數大小。Ct值越大,參與反應的起始的模板量就越小,反之則越大。用SPSS13.0軟件對數據進行統計分析,組間的比較和相關性統計均用χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

以循環數Ct為縱坐標,以樣品各稀釋度的倍數值為橫坐標作標準曲線,觀察到各個指標的擴增效率基本一致,可以用2-△△CT分析數據,結果見表 1。

各組間表達結果差異顯著,同時AFP mRNA、h-TERT mRNA在各組中的陽性表達也存在較大差異,結果見表2。

表2 AFPmRNA、h-TERT mRNA在兩組表達情況[n(%)]

在對照組35例中,無論是AFP mRNA還是h-TERT mRNA,幾乎沒有表達,僅1例h-TERT mRNA表達陽性,而在肝細胞肝癌中二者都有明顯的表達,兩組之間差異具有統計學意義(P＜0.01)。在肝細胞肝癌患者中,AFPmRNA和h-TERT mRNA的陽性檢出率分別為76.7%、83.3%,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。進一步分析它們表達的相關因素,有遠處轉移與肝內轉移者陽性率均為100%。其表達和血清中AFP的量以及腫瘤的分化程度沒有明顯相關性(P＞0.05),與門靜脈癌栓也密切相關(P＜0.05)。

3 討 論

由于mRNA不僅是基因在轉錄水平的表現,也可作為細胞表型的標志,能在細胞無任何形態變化的情況下判斷該細胞的表現型,因此,其作為肝細胞肝癌診斷指標可以發現一些早期甚至是亞臨床期的肝細胞肝癌。現采用外周血循環細胞RNA進行反轉錄PCR檢測腫瘤標志物的表達情況,由此判斷是否存在癌細胞,以達到早期診斷腫瘤的目的。在部分肝細胞肝癌患者中,由于AFP基因在表達過程中翻譯缺失而停止轉錄之后,血清AFP表達為陰性[2],而AFP mRNA則為陽性,故檢測AFP mRNA可對血清AFP陰性的患者做出早期診斷,彌補了現行單純以AFP作為診斷依據的不足。本研究也證實,肝細胞肝癌患者 AFP陽性率為 66.7%,而AFP m RNA的陽性率為76.7%,是比AFP更加敏感的指標。近年來,國內外很多學者報道了RT-PCR法檢測外周血中AFP mRNA在肝癌診斷和鑒別診斷中的作用。石宏等[3]報道檢測患者外周血中癌細胞表達的AFP m RNA陽性率為76%,高于血清AFP陽性率64%,表明檢測AFP m RNA較 AFP靈敏度高,在部分血清AFP陰性的肝細胞肝癌患者,檢測外周血AFPm RNA有助于診斷的確立。Zhu等[4]的研究結果表明,外周血AFP m RNA在原發性肝癌患者中的檢出率為53.7%,AFP mRNA檢出率與血清AFP濃度之間無明顯關系。因此,檢測外周血AFP mRNA與血清AFP有互補性,對血清AFP陰性的部分PHC可做出診斷,提高診斷準確率。本研究以單純的肝細胞肝癌為對象,排除了膽管細胞癌和混合細胞癌,故AFP mRNA的結果更高,達到 76.7%,陽性率也顯著提高。Tamaoki和Fausto[5]認為在肝細胞肝癌患者中,AFP基因的表達再次被激活,其AFP m RNA的水平高于正常肝細胞的30～1 000倍。本實驗證明,如果應用更為靈敏的熒光定量PCR技術,則肝細胞肝癌患者外周血中AFP m RNA的檢出率明顯增高,但總體陽性率仍不是非常滿意,存在偏低的問題。本研究的陽性率也只有76.7%,如果采取聯合檢測h-TERT m RNA則可以較好地解決這個問題。徐焰等[6]證實,聯合檢測可以明顯提高肝癌的診斷率。h-TERT mRNA在良性疾病患者和健康人中幾乎不表達,在惡性腫瘤患者中才會出現較高的表達,是檢測惡性腫瘤的一個很好的標志物。大多數惡性腫瘤端粒酶活性升高,檢測端粒酶的表達為惡性腫瘤的診斷和治療開辟了新的途徑,已成為診斷惡性腫瘤和判斷預后的重要指標。Wang等[7-8]應用熒光定量技術檢測外周血中h-TERT mRNA的表達,結果顯示該項指標在作為腫瘤標志物的價值優于AFP m RNA。本實驗的結果也說明,h-TERT m RNA是比AFP mRNA更敏感的指標,其陽性率達83.3%。總體來說,單純應用一種作為檢驗指標還存在陽性率較低的問題,如果把兩者結合,則可以使肝細胞肝癌的檢出率提高到92.6%,比現行的檢測AFP的做法優越,同時其特異性也達到97.2%,是非常理想的腫瘤診斷標志物。

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[5] Tamaoki T,Fausto N.Expression of theα-fetoprotein gene during develoment,regeneration and carcinogenesis[M].In:Stein,Stein,eds.Recombinant DNA and cell proliferation.San Diego:Academic Press,1984:145.

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