人胰高血糖素樣肽-1類似物基因治療對STZ誘導糖尿病大鼠的拮抗作用*

李曉麗,劉 振,馬衛列,張志珍△

(廣東醫學院:1.生物化學與分子生物學教研室,湛江524023;2.衰老研究所,東莞523808)

目前,糖尿病患病率呈增長趨勢,已成為中國繼心血管疾病、腫瘤之后的第3位疾病[1]。人胰高血糖素樣肽-1(human glucagon-like peptide-1,hGLP-1)是一種腸促胰島素激素,能有效降低血糖,促進胰島素分泌,促進胰島β細胞增殖并抑制其凋亡,在糖尿病基因治療中具有很大潛力[2-3]。本課題組在前期研究中,已成功構建了 hGLP-1類似物基因(2×Val2-hGLP-1)重組表達質粒[4],本實驗旨在將這一重組質粒通過尾靜脈注射導入體內,觀察其對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠的拮抗作用,為臨床治療提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只,體質量200～220 g,由廣東醫學院實驗動物中心提供,許可證號:SCSK(粵)2008-0008。

1.2 實驗材料與試劑 STZ(Merck公司),葡萄糖檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒(上海榮盛生物科技有限公司),胰島素檢測試劑盒(Beckman coulter公司),兔抗大鼠胰島素抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(北京博奧森生物科技有限公司),DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術研究所),質粒DNA大提試劑盒(天根生物科技有限公司),陽離子脂質體(Lipofectamine Invitrogen公司),空載體 pIRES2-EGFP(Invitrogen公司),hGLP-1類似物基因重組表達質粒(p IRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1,由本室構建)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病模型建立及實驗分組 將大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、空載體對照組、基因治療拮抗組,每組 10只。糖尿病模型組、空載體對照組和基因治療拮抗組于實驗開始后第7、8、9、10、11天連續腹腔注射STZ。每組大鼠分別在實驗前1 d禁食12～14 h,自由進水,次日清晨按 40 mg/kg體質量腹腔注射1%STZ,并連續注射5 d[5-6],其中基因治療拮抗組于第1天通過尾靜脈注射陽離子脂質體包裹的重組質粒溶液70μg/只,并于第10天加強1次;空載體對照組按相同方式給予脂質體包裹的空載體溶液;正常對照組給予等體積生理鹽水。

表1 hGLP-1基因拮抗治療對糖尿病大鼠血糖、胰島素及總膽固醇含量的影響(n=10,±s)

表1 hGLP-1基因拮抗治療對糖尿病大鼠血糖、胰島素及總膽固醇含量的影響(n=10,±s)

與實驗前比較,*:P＜0.01,#:P＜0.05;與糖尿病模型組、空載體對照組比較,△:P＜0.01;與正常對照組比較,▲:P＜0.01。

血糖(mol/L)血清胰島素(mIU/L)總膽固醇(mmol/L)組別實驗前 實驗后 實驗前 實驗后 實驗前 實驗后正常對照組 4.85±0.65 5.01±1.03 19.86±1.31 20.08±0.98 1.56±0.16 1.48±0.07空載體對照組 26.32±2.71▲ 30.70±1.89#▲ 4.98±1.21▲ 4.45±0.89#▲ 2.35±0.21▲ 2.49±0.38▲糖尿病模型組 27.41±1.38▲ 30.24±1.78#▲ 4.82±1.04▲ 4.25±0.97#▲ 2.29±0.44▲ 2.51±0.16#▲基因治療拮抗組 25.96±1.24▲ 19.97±1.38*△▲ 4.74±1.05▲ 8.24±0.97*△▲ 2.41±0.34▲ 2.09±0.21*△▲

1.3.2 小量多次給STZ后各組糖尿病成模率 于實驗第1、5、10、15、20天將大鼠空腹 12 h,眼眶靜脈竇采血,4 ℃、4 000 r/min離心10 min分離血清,按試劑盒說明書進行血糖測定,計算各組大鼠成模率。

1.3.3 血糖、血清胰島素及總膽固醇含量測定 實驗前、后,按照上述方法采血并按試劑盒說明書檢測血糖、血清胰島素、總膽固醇水平。

1.3.4 組織細胞中hGLP-1表達的觀察 實驗結束后,將大鼠處死,迅速取出腎臟、肝臟和肌肉組織制作組織印片,借助熒光顯微鏡觀察組織細胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達。

1.3.5 免疫組化分析胰島中胰島素分泌水平的變化 實驗結束后,將大鼠處死,迅速取出胰腺組織,置于10%的甲醛中固定,石蠟包埋切片,厚度為 4μm,常規脫蠟至水,用 3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶,微波加熱暴露抗原,滴加兔抗大鼠胰島素抗體(1∶100),4℃過夜,用PBS洗滌后滴加羊抗兔二抗,于37℃孵育1 h,DAB顯色3～5 min,脫水、透明、封片后進行觀察。采用Imagepro Plus圖像分析軟件,每張切片隨機選取10個視野,分析胰島素染色平均光密度(mean density)=光密度總和(IOD SUM)/胰島素染色面積(area)。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析,計量資料以±s表示,組間比較采用方差分析,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 STZ處理后大鼠糖尿病成模率 見圖1。以相同方式給予STZ后,各組大鼠的糖尿病成模率出現顯著差異。基因治療拮抗組大鼠糖尿病成模率在 STZ處理后第10、15、20天,分別為26.01%、48.69%、48.69%,顯著低于糖尿病模型組和空載體對照組(48.25%、100%、100%,P＜0.01)。STZ處理后5～15 d,各組大鼠的糖尿病成模率均上升(P＜0.01)。

2.2 實驗前、后大鼠血糖、血清胰島素及總膽固醇含量 各組大鼠的血糖、胰島素及膽固醇含量見表1。基因治療拮抗組大鼠給予hGLP-1類似物基因后,其糖尿病癥狀得到緩解,與糖尿病模型組、空載體對照組比較,其血糖水平顯著降低,血清胰島素水平明顯升高,同時總膽固醇水平也明顯改善(P＜0.01或P＜0.05)。

2.3 組織細胞中hGLP-1表達分析 見圖2。熒光顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白(GFP)在肝臟(圖 A)、肌肉組織(圖B)及腎臟(圖C)中的表達。本實驗采用p IRES2-EGFP真核表達載體,該載體多克隆位點和EGFP編碼區基因之間設計有核糖體進入位點(IRES),能夠確保插入的hGLP-1類似物基因與GFP編碼基因共同轉錄,熒光顯微鏡觀察到GFP表達,初步證明了載體已轉入糖尿病大鼠體內,并在組織中表達。

圖1 STZ處理后大鼠糖尿病成模率

2.4 胰島素分泌水平的變化 見圖3。與正常對照組(圖A)比較,糖尿病模型組(圖B)和基因治療拮抗組(圖C)胰島內胰島素分泌顆粒減少。但經過hGLP-1類似物基因治療后,基因治療拮抗組胰島素染色陽性區域的平均光密度(99.91±10.01)顯著高于糖尿病模型組(91.46±8.23,P＜0.05)。

圖 2 組織細胞中 hGLP-1表達的觀察(×100)

圖3 胰島內胰島素分泌的變化(×100)

3 討 論

hGLP-1是一種腸促胰島素激素,進食時小腸上段受到營養物質的刺激,其下段的 L細胞便會分泌出這種肽類激素。它能有效降低機體血糖水平,是目前能誘導胰島素分泌的最強物質之一。但由于絲氨酸蛋白酶-二肽酰基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)的降解,其在體內的半壽期明顯縮短[7]。為了提高其降糖效果,延長半壽期,基于抵抗DPPⅣ的hGLP-1類似物已陸續推向市場,但重復多次的給藥方式使肽類藥物在臨床的應用受到限制,而基因治療作為一種新的治療策略,可以將外源基因轉入體內,使目的蛋白持續性得以表達,因此,基因治療在糖尿病治療中已顯示出巨大前景[8-10]。為此,作者在對hGLP-1基因修飾的基礎上構建了含類似物基因的重組表達質粒,通過陽離子脂質體介導將質粒轉染到大鼠體內,觀察其對STZ誘導糖尿病大鼠的拮抗作用。在基因治療過程中,可選擇腺病毒載體、腺相關病毒載體、脂質體介導等方法將外源目的基因轉入體內。本研究選用經典的基因轉染方法——脂質體介導,用陽離子脂質體Lipofectamine包裹外源hGLP-1類似物基因,通過尾靜脈注射導入體內。hGLP-1類似物基因可能通過內吞、凝集等機制,隨血流進入到肝臟、肌肉組織等細胞中表達。相對于病毒載體介導外源基因的轉染方法,脂質體轉染安全簡便[11],但轉移效率較低是其缺陷,因此,在后續實驗中要對如何提高基因轉染效率、增強目的蛋白的靶向性等問題進行探索。

本實驗在用STZ處理大鼠前7 d,通過尾靜脈注射將重組表達質粒導入體內,并于第10天加強注射1次,而STZ則采用小劑量、多次給藥的方式,分別于第7、8、9、10、11天將STZ腹腔注射入大鼠體內,給予hGLP-1類似物基因治療后,研究發現,在肌肉、肝臟及腎臟組織中觀察到了綠色熒光蛋白GFP的表達,說明載體已成功轉移至大鼠體內。研究結果提示,hGLP-1類似物基因治療對STZ誘導大鼠糖尿病形成有拮抗作用,糖尿病發病率降低,大鼠血糖水平下降,血清胰島素水平升高,同時血清膽固醇水平也得以改善。也有研究顯示,hGLP-1可促進胰島β細胞的增殖、減少β細胞的凋亡,對β細胞的功能恢復有一定的作用。本研究結果也顯示,基因治療拮抗組大鼠胰島中胰島素分泌顆粒明顯增加,胰島β細胞的功能改善。

本實驗采用pIRES2-EGFP真核載體,可使表達的hGLP-1類似物不與GFP融合,保證了其構象與生理活性。借助熒光顯微鏡檢測到GFP,初步證明hGLP-1類似物基因已成功轉入糖尿病大鼠體內并得到表達。總之,本研究采用陽離子脂質體作為載體,將重組質粒導入大鼠體內取得了較好的糖尿病拮抗作用,有望成為糖尿病基因治療的一種方法。

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