羊棲菜受精卵/胚胎低溫保存后的成活和發育

張玉榮, 逄少軍

（1. 浙江省海洋水產研究所, 浙江 舟山 316100; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

ZHANG Yu-rong1, PANG Shao-jun2

（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan, 316100, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

羊棲菜受精卵/胚胎低溫保存后的成活和發育

張玉榮1, 逄少軍2

（1. 浙江省海洋水產研究所, 浙江 舟山 316100; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

通過實驗生物學方法, 探討了采用5℃條件保存的多細胞和兩細胞狀態羊棲菜（Hizikia fusiformis）受精卵的成活和發育情況。結果表明, 相同保存和恢復培養條件下的羊棲菜受精卵, 兩細胞狀態的死亡率明顯高于多細胞狀態。5℃條件保存60 h多細胞狀態羊棲菜受精卵的死亡率均在10%左右, 同樣條件保存 48 h 兩細胞狀態受精卵死亡率高達 75%。在異地運輸羊棲菜受精卵或者胚胎完成苗種培育的過程中, 應當同時考慮溫度、運輸時間以及受精卵的發育階段等多個因素, 才能取得比較好的實際效果。

羊棲菜（Hizikia fusiformis）; 受精卵; 低溫保存; 成活和發育

羊棲菜（Hizikia fusiformis）隸屬褐藻門, 墨角藻目, 馬尾藻科, 是暖溫帶-亞熱帶性海藻, 在我國沿海北自遼東半島南到廣東雷州半島以及在日本和朝鮮沿岸均有廣泛分布[1]。羊棲菜藻體肥厚多汁, 營養豐富、風味好, 既能食用又能藥用, 是中國、日本、朝鮮和韓國沿海人民的傳統美食和中草藥, 被推崇為海洋蔬菜和健康長壽品[2～4]。我國古代《神農本草經》和《本草綱目》中對羊棲菜藥用價值都有記載。羊棲菜人工栽培所使用的苗種在早期基本來自潮間帶, 隨著羊棲菜全人工苗種技術的誕生和日益成熟,利用雌雄異體親本同步受精技術來生產種苗在生產中得到廣泛應用[5～8]。在實際生產過程中, 為規避由于高水溫對幼苗的不利影響[9], 有時需要異地運輸種菜完成苗種培育或者通過低溫保存的方式異地運輸受精卵和胚胎。目前人們對羊棲菜受精卵或者胚胎在低溫條件下的存活和發育規律所知甚少, 而低溫保存海藻種質細胞已經在多數經濟海藻中得到廣泛的應用[10]。 本項研究的主要目的就是探討羊棲菜在不同發育階段, 經過不同時間的低溫處理后的存活和生長發育情況, 旨在為改善羊棲菜全人工苗種工藝提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 羊棲菜親本

羊棲菜為2008年5月初采自浙江省南麂島, 利用保溫盒空運至青島, 雌雄各20枝、每枝長約20 cm,置于中國科學院海洋研究所海洋生物種質庫種質培養室80 L （65 cm×45 cm×35 cm） PP水箱恢復培養,水溫 20℃, 培養的最高自然太陽光光強 400 μmol/（m2?s）[11～13]。材料培養期間, 每天流水換水一遍,并添加NaNO3和KH2PO4, 添加的終濃度達到10 g/m3和1 g/m3水體。經過一段時間的培養, 卵子和精子排放后, 對不同時間段的受精卵進行低溫5℃保存。本實驗共使用了兩批多細胞和兩細胞狀態受精卵。

1.2 實驗方法

羊棲菜卵子在受精后的16 h開始從生殖托自然脫落, 脫落的受精卵都處于多細胞的胚胎階段。從實際操作角度, 運輸脫落的胚胎比運輸尚黏附在生殖托上的受精卵要容易得多。但是為了全面了解不同階段的存活和生長情況, 采取了 2個發育階段的材料, 即受精后8 h和24 h的2細胞和多細胞材料。

1.2.1 多細胞狀態5℃保存

受精24 h的羊棲菜受精卵, 經鏡檢基本發育到多細胞的胚胎狀態。待大部分自然脫落后, 取適量放入200 mL燒杯, 加適量消毒PES（Provasli Enriched Water）[14], 放入5℃冰箱保存。放置0, 6, 12, 24, 30, 36,48, 54, 60, 72, 78, 96 h 后, 分別取適量放入9 cm培養皿中, 在倒置顯微鏡下檢查和統計假根發生率和胚胎的死亡率。之后, 加入適量的PES, 在21℃光照培養箱靜置培養, 光強 190 μmol/（m2?s）。分別統計培養48, 96, 144 h后的死亡率。除特殊說明, 實驗中均用光度計（SAMPO-LX1330A）記錄光照強度, 每48 h更換培養基。

1.2.2 兩細胞狀態5℃保存

受精8 h的羊棲菜受精卵, 經鏡檢多數為兩細胞狀態。取適量放入200 mL燒杯, 加適量PES, 5℃冰箱保存。保存0, 24, 48, 96 h和 120 h后, 分別取出并統計死亡率和假根產生率。之后加適量PES, 21℃光照培養箱靜置培養, 光強 190 μmol /（m2?s）。統計培養48 h后的存活和死亡率。

2 結果

2.1 多細胞狀態5℃保存

2.1.1 多細胞狀態 5℃保存, 取出時假根發生的比例

5℃條件保存多細胞狀態羊棲菜胚胎（受精 24 h后）在48 h以內, 隨著時間的延長, 個體發生假根的比例從10%上升到80%; 當保存的時間超過50 h后,假根的發生便停止 （圖 1）。意味著 50 h 是一個分界點。

離任審計指的是審查、核實地勘單位法定代表人在任職期間內所需要承擔的經濟責任，并對經濟責任展開一定的分析，此舉有助于規范并引導相關人員的經營思想與經營活動，因此離任審計工作對地質勘查單位而言意義非凡。然而現如今我國有關地質勘查單位的離任審計工作存在許多尚未解決的問題，嚴重滯緩相關單位的工作，有效地發現并解決離任審計工作任務已成為當務之急。

圖1 在5℃保存不同時間的多細胞狀態羊棲菜胚胎（受精24 h后）產生假根的比率平均值變化（n=5）Fig. 1 Percentage of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat developed rhizoids after being stored at 5℃for various hours. Values are means ± standard deviations （n= 5）

2.1.2 多細胞狀態 5℃保存, 取出放入培養箱培養時的死亡率

5℃條件保存多細胞狀態羊棲菜胚胎（受精 24 h后）的死亡率, 96 h內均低于5%, 在保存了120 h后死亡率迅速增加, 但是在保存了216 h的死亡率仍然低于 45%（圖 2）。

圖2 在5℃保存不同時間的多細胞狀態羊棲菜受精卵（受精24 h后）的死亡率平均值（n=5）Fig. 2 Mortality of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat were stored at 5℃ for various hours. Values are means ± standard deviations（n= 5）

2.1.3 多細胞狀態5℃保存, 恢復培養后的死亡率

5℃條件保存多細胞狀態的羊棲菜胚胎（受精 24 h后）, 經過48 h恢復培養后, 保存60 h以內的羊棲菜受精卵的死亡率均在10%左右（圖3）, 而且細胞發育良好（圖4）, 72 h后死亡率迅速增加, 96 h為80%。當保存時間達到120 h時, 沒有胚胎能夠恢復, 死亡率達到100%。

2.2 兩細胞狀態5℃保存

2.2.1 兩細胞狀態 5℃保存, 取出放入培養箱時的假根率和死亡率

圖3 在5℃保存不同時間的多細胞狀態羊棲菜胚胎（受精24 h后）, 取出后恢復培養48 h后的死亡率平均值（n= 5）Fig. 3 Mortality of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat were stored at 5℃ for various hours followed by a 48-h recovery culture period at standard culture conditions. Values are means ± standard deviations （n= 5）

圖4 受精24 h后多細胞狀態羊棲菜胚胎（A）和在5℃保存24 h后再在標準條件下（21℃, 190 μmol /（m2?s）） 恢復培養48 h后（B）, 其存活和形成長的假根狀況（標尺是100 μm）Fig. 4 Embryos ofHizikia fusiformisat 24 h post-fertilization （A）, and the embryos stored at 5℃ for 24h followed by a 48 h recovery in standard culture conditions （B）

3 討論

處在不同發育階段的羊棲菜受精卵進行低溫保存后的存活和生長迥然不同：實驗結果表明, 經過48 h恢復培養后, 5℃保存60 h的多細胞狀態羊棲菜受精卵的死亡率只有 10%, 而兩細胞狀態羊棲菜受精卵保存48 h后死亡率則為75%。因此在相同低溫保存和常溫恢復培養條件下, 羊棲菜多細胞狀態的胚胎存活率明顯高于兩細胞受精卵階段。在實際操作過程中, 受精卵的實際發育階段是決定后期存活率的關鍵因素。

表1 在5℃條件下保存的兩細胞受精卵分別在0, 24, 48,72 h后取出, 再恢復性培養48 h的死亡率和產生假根的比率（n=6）Tab. 1 Mortality and rates of rhizoid development of the 2-celled zygotes after 0, 24, 48 and 72-h storage at 5℃ and followed by a 48-h recovery under standard culture conditions （n= 6）

圖5 5℃保存的2個細胞的受精卵在保存120 h后取出,出現的單細胞、兩細胞和三細胞受精卵產生長假根的情況（箭頭所示, 標尺為100 μm）Fig. 5 Rhizoid development （arrows） from one-, two-, or three-celled zygotes after stored at 5℃ for 120 h（bar equals to 100 μm）

低溫保存后產生假根的時間問題：在羊棲菜苗種實際培育過程中, 產生假根的時間十分關鍵, 附苗時間必須根據產生假根時間確定。附苗過遲, 容易導致后期脫苗[15,16]。采用低溫保存受精卵也是如此。從本研究的實驗結果來看, 無論是2細胞的受精卵還是多細胞胚胎采用低溫保存都不能阻止假根的形成,而只能延緩假根形成和生長速度。這個特點對異地運輸受精卵或者胚胎完成采苗是個困難, 要求必須在假根形成之前完成運輸和布苗。至于詳細的假根發生和長度定量測定需要將來更加細致的研究闡釋。對于異地運輸受精卵或者胚胎而言, 掌握時間的長短和溫度的控制同樣重要。在動物水產養殖過程中, 利用充氧塑料袋運輸魚苗或者貝類幼體已經得到廣泛應用, 而在藻類苗種培育過程中, 尚沒有先例。作者在2008年, 利用低溫運輸受精卵的方法完成了大規模苗種采集, 并且獲得了成功。本文的研究結果, 將對馬尾藻屬海藻的苗種培育技術革新提供重要的技術支持。

致謝:作者感謝實驗室技術員高素芹, 宋春華, 張京浦等同事的幫助。

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Survival and growth performance of zygotes/embryos of the brown alga Hizikia fusiformis after low temperature treatments

ZHANG Yu-rong1, PANG Shao-jun2

（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan, 316100, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

Received: Nov., 25, 2008

Key words:Hizikia fusiformis; zygotes; low temperature; cultivation

Abstract:Hizikia fusiformishas been an important export-orientated brown alga in China. Large-scale cultivation relies on the supply of seedlings that are derived from sexual reproduction. With the development of the technique of synchronized fertilization, more and more seedlings are now produced via sexual reproduction. In this investigation, we performed a series of experiments to understand how zygotes of this alga develop and grow after short-term treatments at low temperature. Multi-celled embryos or two-cell zygotes ofH. fusiformiwere preserved at 5℃, for varied durations. The development of rhizoids, survivals of individuals, and growth performances were investigated.The results showed that the death rate of the two-cell zygote was conspicuously higher than that of the multi-cell zygote under the same conservation and recovering culture condition. The mortality of the multi-cell embryos was 10% after 60 h at 5℃, while that of the two-celled zygotes reached 75% after being preserved under the same condition. Discoveries in this investigation paved the way for transporting zygotes or embryos of this alga for completion of seedlings production over distance along the coast.

（本文編輯: 張培新）

Q178

A

1000-3096（2010）12-0070-05

2008-11-25;

2009-04-10

國家863計劃項目 （2006AA10A412, 2006AA10A416）; 國家自然科學基金項目（30671596, 30471327）; 國家科技基礎條件平臺工作項目（2006DKA30470-017）

張玉榮（1984-）, 女, 江蘇徐州人, 碩士, 從事大型藻種質保存研究: 逄少軍, 通信作者, E-mail: sjpang@ms.qdio.ac.cn, 電話: 0532-82898831