中國明對蝦caspase基因的克隆與表達分析

宋光年, 金松君, 張繼泉, 相建海

（1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049）

中國明對蝦caspase基因的克隆與表達分析

宋光年1,2, 金松君1, 張繼泉1, 相建海1

（1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049）

利用細胞凋亡來清除多細胞器官受損傷或有害的細胞, 為動物發育過程中保持機體平衡起到關鍵作用。為了研究細胞凋亡在甲殼類動物應對病毒感染后所起到的作用, 作者利用同源克隆技術獲得了中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis） caspase基因（FcCasp）的cDNA序列, 并分析了該基因在對蝦受到白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus,簡稱WSSV）刺激后的表達變化規律。結果表明, 該基因的cDNA含有954個核苷酸, 編碼317個氨基酸, 具有caspase家族典型的QACRG五肽蛋白酶活性位點（190-194氨基酸）。對注射了WSSV的中國明對蝦FcCasp的表達進行分析, 在5個時間點取其肝胰臟樣本, 經real-time PCR檢測發現, WSSV刺激3 h后, 對蝦肝胰臟中FcCasp的表達呈現顯著性上調,說明FcCasp的表達與WSSV感染密切相關, 提示FcCasp基因與細胞凋亡相關。

中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）; 基因克隆; Caspase; WSSV攻毒; 實時定量PCR分析

對蝦是目前世界上大規模養殖、效益好的水產品種類之一, 在中國水產養殖業中占據舉足輕重的地位, 1988～1992年, 中國養殖對蝦的年產量一直保持在 20 萬 t左右, 占世界對蝦年總產量的 1/3, 居世界第一位[1]。由于病害頻發, 特別是 1993年以來開始爆發的 WSSV病毒性疾病, 使中國養殖對蝦的產量由1992年的20萬t減至1993～1994年的5萬～6萬t, 給對蝦養殖業的發展造成了巨大損失[2]。迄今,尚未找到特效的病害防治方法來對付對蝦WSSV病害的危害。研究對蝦對病原感染的免疫應答機制, 可以為有效地進行對蝦的病害防治提供重要的理論指導。

1972年, Kerr等[3]提出細胞凋亡的概念。細胞凋亡, 又稱程序性細胞死亡（programmed cell death, 簡稱 PCD）, 是多細胞生物調控機體發育、維護內環境穩定的一個重要的生理過程[4]。細胞凋亡是由基因控制的, 其核心的分子機制首先在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中得到闡明。1992年, Cerretti等[5]發現哺乳動物的白細胞介素-1β轉換酶（leukin 1-converting enzyme, 簡稱 ICE）與其他已知的哺乳動物蛋白幾乎沒有同源性, 但與秀麗隱桿線蟲中促進細胞凋亡的 CED-3基因有很高的同源性, 這引起了人們對這類蛋白酶在細胞凋亡的作用的廣泛研究。到1996年為止, 人們已經發現了10個ICE/CED-3的同源物[6,7], 生物體利用這種機制有效地清除了衰老細胞和畸形細胞, 它們都是結構相似的半胱氨酸蛋白酶, 并能特異地切割 Asp后的肽鍵, 所以人們將其統一命名為 caspase[8]。2000年,Sperandio等[9]發現一種與細胞凋亡現象不同而且不受凋亡因子調控的細胞自行死亡的形式, 稱為“paraptosis”。2007 年, Overholtzer等[10]發現一種通過特殊的細胞吞噬細胞導致細胞死亡的方式, 他把這種全新的細胞死亡方式稱為“entosis”。

caspase家族成員有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性。caspase的分子量大約在30～50 kd, 通常以無活性的蛋白酶原形式在細胞內進行合成和分泌。結構上, caspase可以分成 3部分, N-端前肽（prodomain）、大亞基（p20, 20kD）和小亞基（p10,10kD）。Prodomain與 caspase分子的功能密切相關,功能性caspase分子的Prodomain長度小于30個氨基酸, 而與炎癥相關的caspase分子的Prodomain長度則大于100個氨基酸。長的Prodomain往往含有明顯的功能域, 如 caspase募集結構域（caspase recruitment domain,簡稱 CARD）、死亡效應結構域（death effector domain,簡稱DED）、死亡誘導結構域（death inducing domain,簡稱 DID）等[11,12]。這些功能域參與caspase分子之間的相互作用、caspase酶原的活化和 caspase分子的亞細胞定位等[12,13], 而短的Prodomain的功能可能是抑制 caspase的活化[14]。caspase在大亞基上均含有QACXG五肽保守序列（X代表R、Q）。在各種caspase酶原間, 大小亞基的同源性較高, 而 N-端前肽的同源性較低, 這是區別caspase家族各成員的主要指標。

作者以中國明對蝦為研究對象, 利用同源克隆的方法獲得了中國明對蝦FcCasp基因的cDNA序列,利用real time PCR研究了WSSV刺激后對蝦肝胰臟中該基因表達變化規律, 初步探討了該基因與對蝦免疫的關系, 為深入系統了解對蝦的先天性免疫機制增添了新的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

中國明對蝦（體長14.5 cm± 0.6 cm）購于青島市南山市場, 實驗前在水族箱中充氣暫養 10 d, 使其適應實驗室內養殖環境。取健康對蝦肝胰臟, 并分離胃、腸、神經節、淋巴器官、腮等組織, 提取總RNA用于cDNA合成。

1.1.2 實驗所用引物

其中, 括號中的R代表（A、G）, Y代表（T、C）, D代表（G、A、T）, K代表（G、T）, S代表（C、G）。

1.2 WSSV感染實驗

WSSV組織提取液的制備方法如下: 將于?80℃保存的感染WSSV的中國明對蝦組織10 g（中國水產科學院黃海水產研究所黃 教授惠贈）, 按 1∶1（W/W）比例加入含 2.4%氯化鈉的 PBS, 在冰浴中勻漿10 s, 勻漿液在3 800 g, 4 ℃離心15 min, 沉淀加入同體積的PBS, 按上述方法勻漿和離心兩次, 3次所得上清合并, 加入蔗糖至 30%濃度; 于 31 000g,4 ℃離心50 min, 棄上清, 沉淀用25 mL生理鹽水懸浮, 備用。

選取健康對蝦若干尾, 采用腹節注射法進行WSSV感染實驗。用WSSV懸液從對蝦最后腹節進行注射, 每只蝦注射20 μL。感染實驗的對照組, 每尾對蝦注射20 μL無菌PBS 溶液。免疫注射后0、3、5、12、24、48、72 h 分別取蝦8尾, 解剖取其肝胰臟組織, 用于總RNA 的提取。

用注射器從對蝦第一腹節基部腹竇處取血淋巴,加入等體積的抗凝劑。8尾對蝦的血淋巴混在一起,4oC, 800 g離心10 min, 收集的血細胞用于總RNA的提取。同時, 解剖未處理對蝦的各組織, 液氮中凍存, 用于后期的RNA提取。

1.3 RNA的提取和cDNA合成

利用Unizol試劑盒（上海博星公司）提取總RNA,方法參照使用說明書。用紫外分光光度計對RNA進行定量檢測, 然后進行 MOPS瓊脂糖凝膠電泳, 確認RNA無降解后, ?80℃保存備用。在進行反轉錄之前, 使用 RQ1 RNase-Free DNase（Promega, USA）去除總RNA中殘留的基因組DNA。cDNA合成體系如下: 在 25 μL的反應體系中加入 2 μg總 RNA,1×MMLV 緩沖液, 0.5 mmol/L dNTP, 0.4 mmol/L oligo-dT（或六聚體隨機引物）, 20 units RNase抑制劑（Promega）和 200 units MMLV 反轉錄酶（Promega）,用于特異性基因片段克隆的cDNA, 用oligo-dT進行反轉錄; 用于基因表達定量分析的cDNA, 用隨機引物六聚體進行反轉錄。

1.4 caspase基因cDNA（FcCasp）片段的克隆

根據NCBI上已經公布的部分caspase的氨基酸序列: 家蠶（Bombyx mori） （BAF74126）、瘧蚊（Anopheles gambiae） （XP_308993）、墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis） （AY839873.1）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei） （EU421939.1）、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus） （EF079670.1）和斑節對蝦（Penaeus monodon） （DQ846887.1）, 設計簡并引物CAS3-dF和 CAS3-dR, 以中國明對蝦血細胞 cDNA為模板, 擴增中國明對蝦caspase基因片段。PCR反應條件為94℃變性4 min; 94℃變性30 s, 62℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 共35個循環; 72℃延伸10 min。擴增片段克隆到pMD19-T載體（大連寶生物公司）中, 重組質粒轉化到大腸桿菌 TOP10菌株, 挑取克隆經PCR驗證后進行測序。

1.5 生物信息學分析

將測序獲得的序列利用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov網站上的 BLAST工具進行數據庫基因序列相似性及同源性的查找和比較。全長序列ORF分析等用 Bioedit軟件進行。選取部分在 GenBank中與FcCasp相似的其他物種的caspase序列, 采用Clustal W軟件進行多序列比對分析。將根據cDNA 序列推導的氨基酸序列利用 http://www.expasy.ch網站提供的蛋白質組和序列分析工具（Proteomics and sequence analysis tools）進行分析; 用 ProtParam 軟件進行蛋白質基本物理化學參數分析。

1.6 FcCasp的表達分析

利用 real-time PCR檢測中國明對蝦肝胰臟中FcCasp在注射WSSV不同時間后轉錄水平的表達變化。取實驗組和對照組不同時間點取樣保存的肝胰臟樣品, 按前述方法分別提取總 RNA并反轉錄成cDNA后用于定量 PCR檢測。利用 RT-CASF/RTCASR進行轉錄表達檢測。擴增片段大小為 129bp,同時利用中國明對蝦 18S rRNA作為參考基因, 以18S-F/18S-R為引物對擴增產生136bp的PCR產物。real-time PCR 反應在 Eppendorf 公司 Mastercycler ep realplex 4S PCR 儀上進行, 采用Blend Taq-Plus-PCR 反應體系（TOYOBO）, 所用染料為 SYBR Green。每個時間點的cDNA樣品做兩組PCR, 一組為內標基因 18S rRNA, 另一組為目的基因 FcCasp,每組反應進行3次重復。18S rRNA 基因的反應條件為: 94 ℃變性2 min, 1個循環; 94 ℃變性15 s, 55℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s, 40個循環。FcCasp基因的反應條件為: 94 ℃變性2 min, 1 個循環; 94 ℃變性15 s, 59.1 ℃退火20s, 72 ℃延伸20 s, 40個循環。數據處理采用2-??Ct 方法[15]。

2 結果

2.1 中國明對蝦FcCasp的部分cDNA片段的克隆

通過PCR擴增獲得了954bp的cDNA片段, 經過NCBI數據庫BlastX比對（圖1）, 發現它與caspase家族基因具有很高的同源性, 該cDNA編碼317個氨基酸。FcCasp蛋白的預測分子量為35592.8Da, 理論等電點為5.37。通過功能域分析發現FcCasp推導的氨基酸序列中含有1個caspase家族典型的QACRG五肽保守序列（定位在190-194位氨基酸）。P20大亞基定位在 67-196位氨基酸, P10小亞基定位在218-317位氨基酸。

2.2 FcCasp的組織分布

采用real-time PCR方法分析FcCasp在其不同組織中的表達情況（圖 2）。從圖 2中可以看出 FcCasp在各組織中均有表達, 其中在鰓、胃和腸等組織中表達量較低; 在血細胞、淋巴器官和肝胰臟等組織中表達量較高; 在血細胞中表達水平最高。

2.3 中國明對蝦 FcCasp與已報道的其他物種caspase的比較

作者比對了來自不同物種的 26個caspase的氨基酸序列, 利用 MEGA4.1軟件對這些 caspase進行了分子系統學分析, 在構建系統發生樹的基礎上研究了中國明對蝦 FcCasp的分類歸屬以及 FcCasp和其他物種caspase之間的進化關系, 結果如圖3所示。由圖3可見, 系統進化樹分叉為兩個分支: 脊椎動物（人）的caspase與無脊椎動物（包括昆蟲、海洋無脊椎動物）分別屬于兩個不同的類群, 這就體現了不同物種caspase的進化差異。所有關于人、鼠、非洲爪蟾（Xenopes laevis）和斑馬魚（Danio rerio）的caspase都聚在進化樹的一分支。而中國明對蝦的FcCasp則與瘧蚊（Anopheles gambiae）、果蠅（Drosophila Virilis）、凡納濱對蝦, 以及其他“昆蟲型（insect-type）”的 caspase共同聚類于進化樹的另一分支, 這個分支上的蛋白全都由無脊椎動物的caspase組成。

2.4 注射 WSSV后 FcCasp在中國明對蝦肝胰臟中的轉錄表達

WSSV感染后, 中國明對蝦肝胰臟中FcCasp的表達變化如圖4所示。在注射后12 h, 對蝦肝胰臟中FcCasp明顯上調表達, 并達到表達的最高值。而在注射后 48 h, 肝胰臟中 FcCasp的表達有明顯下降,并低于0 h的表達量; 在注射后72 h, FcCasp的表達大致恢復到注射前的水平。

3 討論

圖1 中國明對蝦FcCasp核苷酸和推導的氨基酸序列Fig. 1 cDNA and deduced amino acid sequences of FcCasp ofFenneropenaeus chinensis

有關caspase的基因克隆、表達已經在許多物種中得到研究。推測的蛋白質包含一個典型的保守蛋白酶活性結構域, 存在于大多數的caspase中。通常caspase以非活性狀態存在, 由兩個連續的蛋白水解激活, 首先位于caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除 N-端前肽, 然后在大小亞基之間切割釋放大小亞基, 由大亞基和小亞基組成異源二聚體, 再由兩個二聚體形成有活性的四聚體[16,17]。這些短的N-端前肽可能與哺乳動物的caspase-3和7相似, 起到效應 caspase的作用[18,19]。在本研究中,克隆得到的caspase cDNA的ORF、蛋白的推導分子量、典型蛋白酶切活性結構域、推導切割位點以及N-端前肽都與先前的已報道的研究相似[20]。這個結果清晰地表明本研究分離得到的caspase與其他甲殼類動物的caspase具有高度相似性。

圖2 FcCasp在中國明對蝦中的組織分布Fig. 2 Tissue distributions of FcCasp inFenneropenaeus chinensis

圖3 中國明對蝦的FcCasp和其他物種caspase構建的系統進化樹◆表示本研究中的物種Fig. 3 Phylogenetic analysis on the amino acid sequence of FcCasp and caspase family members of other species◆denotes the species in this study

多細胞器官廣泛利用細胞凋亡來清除受損傷或有害的細胞, 為動物發育過程中保持機體平衡起到關鍵作用[21]。在脊椎動物中, 胸腺中的細胞凋亡是淋巴細胞死亡的主要機制。本研究通過使用 real-time PCR的方法, 發現FcCasp基因廣泛分布在對蝦組織中, 包括血細胞、肝胰臟、腮、淋巴器官、神經節等,但沒有發現該基因在心臟中存在。

caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中有重要作用, 它們接受外界信號, 使細胞發生細胞凋亡, 它們還是細胞凋亡過程中的具體執行者, 完成對特定蛋白底物的水解, 從而使細胞顯示出一系列細胞凋亡的特征。作者利用real-time PCR分析研究的結果表明, 對蝦肝胰臟FcCasp基因在WSSV[22]感染后出現明顯的上調表達。FcCasp基因的表達與病毒刺激有相關性, 說明該基因可能參與了對蝦抗病毒免疫過程, 推測該基因可能會通過細胞凋亡清除體內被病毒感染的細胞, 從而清除體內的病毒, 進而起到抗病毒的作用。目前已報道的有 4種對蝦 caspase: 凡納濱對蝦、日本囊對蝦[23]、斑節對蝦[24]、墨吉明對蝦[25], 但對對蝦的 caspase具體功能目前尚不完全清楚, 還正在進一步研究之中。迄今, 對蝦相關基因的研究還處于一個起步的階段, 主要由于還沒有一套成熟的系統可用于研究對蝦基因的功能。相比哺乳動物而言, 由于沒有對蝦細胞系, 進行其基因功能研究, 顯得十分困難。在接下來的工作中, 通過獲得的FcCasp cDNA序列, 將采用RNAi技術用于對蝦基因功能的研究。FcCasp基因特異的dsRNA推測可能特異地抑制該基因的轉錄表達, 由此來進一步研究該基因的作用, 為對蝦免疫病害防治提供指導。

圖4 對蝦肝胰臟FcCasp基因在WSSV刺激后不同時間轉錄水平的變化Fig. 4 Profile of FcCasp expression in the hepatopancreas of shrimps challenged with WSSV

[1] 劉瑞玉, 胡超群, 曹登宮. 我國對蝦養殖的現狀、研究進展與存在的若干問題. 第四屆世界華人蝦類養殖研討會論文集[C]. 青島: 海洋出版社, 2004. 1-15.

[2] 相建海. 海水養殖生物病害發生與控制[M]. 北京:海洋出版社, 2001. 1-200.

[3] Kerr J F, Wyllie A H, Currie A R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J]. British Journal of Cancer, 1972,26: 239-257.

[4] Jacobson M D, Weil M, Raff M C. Programmed cell death in animal development[J]. Cell, 1997, 88（3）:347-354.

[5] Cerretti D P, Kozlosky C J, Mosley B,et al. Molecular-cloning of the interleukin-1-Beta converting znzyme[J]. Science, 1992, 256: 97-100.

[6] Alnemri E S, Livingston D J, Nicholson D W,et al.Human ICE/CED-3 protease nomenclature[J]. Cell,1996, 87（2）: 171.

[7] Nicholson D W, Ali A, Thornberry N A,et al. Identification and inhibition of the Ice/Ced-3 protease necessary for mammalian apoptosis[J]. Nature, 1995, 376:37-43.

[8] 李小明, 宋天保. “殺手”蛋白酶caspase[J]. 細胞生物學雜志, 2000, 22: 58-63.

[9] Sperandio S, Bredesen D E. An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97（26）:14 376-14 381.

[10] Overholtzer M, Mailleux A A, Mouneimne G,et al. A nonapoptotic cell death process,entosis, that occurs by cell-in-cell invasion[J]. Cell, 2007, 131: 966-979.

[11] Hu S, Yang X. dFADD, a novel death domain-containing adapter protein for the Drosophila caspase DREDD[J]. Journal of Biological Chemistry,2000, 275（40）: 30 761-30 764.

[12] Boldin M P, Varfolomeev E E, Pancer Z,et al. A novel protein that interacts with the death domain of Fas/Apol contains a sequence motif related to the death domain[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995,270（14）: 7 795-7 798.

[13] Fernandes-Alnemri T, Armstrong R C, Krebs J,et al. In vitro activation of CPP32 and Mch3 by Mch4, a novel human apoptotic cysteine protease containing two FADD-like domain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93: 7 464-7 469.

[14] Meergans T, Hildebrandt A K, Horak D,et al. The short prodomain influences caspase3 activation in HeLa cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 349:135-140.

[15] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（T）（-Delta Delta C） method[J]. Methods, 2001,25（4）: 402-408.

[16] Cohen G M. Caspases: the executioners of apoptosis[J].Journal of Biological Chemistry, 1997, 326: 1-16.

[17] Wolf B B, Green D R. Suicidal tendencies: Apoptotic cell death by caspase family proteinases[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274（29）: 20 049-20 052.

[18] Song Z W, McCall K, Steller H. DCP-1, aDrosophilacell death protease essential for development[J]. Science, 1997, 275: 536-540.

[19] Fraser A G, Evan G I. Identification of aDrosophilamelanogasterICE/CED-3-related protease, drICE[J].The EMBO Journal, 1997, 16（10）: 2 805-2 813.

[20] Rijiravanich A, Browdy C L, Withyachumnarnkul B.Knocking down caspase-3 by RNAi reduces mortality in Pacific white shrimpPenaeus（Litopenaeus）vannameichallenged with a low dose of white-spot syndrome virus[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008,24（3）: 308-313.

[21] Weinrauch Y, Zychlinsky A. The induction of apoptosis by bacterial pathogens[J]. Annual Review of Microbiology, 1999, 53: 155-187.

[22] Chang C C, Yeh M S, Lin H K,et al. The effect ofVibrio alginolyticusinfection on caspase-3 expression and activity in white shrimpLitopenaeus vannamei[J].Fish & Shellfish Immunology, 2008, 25（5）: 672-678.

[23] Wang L, Zhi B, Wu W,et al. Requirement for shrimp caspase in apoptosis against virus infection[J]. Development and Comparative Immunology, 2008, 6:706-715.

[24] Leu J H, Kuo Y C, Kou G H,et al. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein（IAP） from the tiger shrimp,Penaeus monodon[J]. Development and Comparative Immunology, 2008,32（2）: 121-133.

[25] Phongdara A, Wanna W, Chotigeat W. Molecular cloning and expression of caspase from white shrimpPenaeus merguiensis[J]. Aquaculture, 2006, 252 （2-4）:114-120.

Received: Apr., 1, 2010

Key words:Fenneropenaeus chinensis; caspase gene cloning; WSSV challenge; real-time PCR

Abstract:Apoptosis eliminates unwanted cells, from an organism including damaged and virus-infected cells, being a fundamental cellular process that plays a critical role in normal development and tissue homeostasis. Here we studied a caspase homolog from Chinese shrimpFenneropenaeus chinensis,designated FcCasp. An open reading frame of 954 nucleotides encoding 317 amino acids （aa） contained a conserved motif, QACRG, of known caspases-3, and was located at aa 190–194. FcCasp expressions were measured in normal shrimp and in shrimp infected by white spot syndrome virus （WSSV） at five time-points post-injection （p.i.） with real-time PCR, revealng different expression profiles of FcCasp gene in hepatopancreas of shrimps after they were challenged by WSSV.The transcription of FcCasp in hepatopancreas showed up-regulation 12 h post-challenge, indicating the expression of FcCasp was closely related to WSSV challenge. Therefore, FcCasp might be involved in the apoptosis.

（本文編輯:譚雪靜）

Cloning and expression of a caspase gene in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

SONG Guang-nian1,2, JIN Song-jun1, ZHANG Ji-quan1, XIANG Jian-hai1
（1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Q789

A

1000-3096（2010）12-0001-07

2010-04-01;

2010-10-10

國家 973資助項目（2006CB101804）; 國家 863計劃項目（2006AA10A401）; 國家自然基金項目（30970422）

宋光年（1984-）, 男, 山東省青島人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物分子生物學研究, 電話: 0532-82898570, E-mail: songpeter@163.com; 相建海, 通信作者, E-mail: jhxiang@qdio.ac.cn