青蛤受精和早期卵裂過程中核相的細胞學變化

董迎輝, 陳 杰, 林志華, 胡利華, 孫長森

（1. 浙江萬里學院 生物與環境學院, 浙江 寧波 315100; 2. 浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江 溫州 325005;3. 臺州學院 生命科學學院, 浙江 臨海 317000）

青蛤受精和早期卵裂過程中核相的細胞學變化

董迎輝1, 陳 杰1, 林志華1, 胡利華2, 孫長森3

（1. 浙江萬里學院 生物與環境學院, 浙江 寧波 315100; 2. 浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江 溫州 325005;3. 臺州學院 生命科學學院, 浙江 臨海 317000）

利用Hoechst 33258染色、熒光顯微鏡觀察方法, 對青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））受精和早期卵裂過程中的核相變化進行了細胞學研究。結果表明: 青蛤成熟未受精卵呈圓球形, 核內同源染色體排列整齊, 核相處于第一次成熟分裂中期。在水溫25～26℃條件下進行人工授精, 精卵混合后, 精子迅速附著于卵子表面; 受精后5～10 min, 精子進入卵內并明顯膨脹成球形; 分別在10～15 min、20～25 min受精卵進行兩次成熟分裂, 排出第一、第二極體; 30 min左右, 精、卵核體積膨脹, 形成彌散狀的雌、雄原核; 35 min, 雌、雄原核在卵子中央發生原核聯合, 染色體共同排列在紡錘體的赤道板上, 形成第一次有絲分裂的中期分裂相; 40～45 min, 受精卵進行第一次卵裂, 形成 2個大小不等的分裂球; 55～60 min, 第二次卵裂結束, 形成1大3小4個卵裂球, 卵裂過程中的核相變化與第一次卵裂基本相同;70 min左右, 胚胎開始第三次卵裂。另外, 在青蛤受精過程中發現了約1%的多精入卵現象, 且入卵精核均能形成雄原核, 但多精受精對成熟分裂和有絲分裂過程有很大影響, 往往造成成熟分裂紊亂和第一次卵裂染色體分離異常。

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））; 受精; 早期卵裂; 多精入卵; 細胞學觀察

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））是中國南北沿海習見的經濟貝類, 其肉味鮮美、營養豐富, 且有清熱利濕、化痰散結之功效[1], 歷來是沿海居民喜食的海鮮佳品。20世紀80年代, 青蛤的土池育苗[2]和室內人工育苗[3]相繼取得成功, 育苗技術的突破與逐漸成熟為青蛤養殖業的快速發展奠定了堅實基礎。加之青蛤具有生長快、適應性廣和抗逆性強等優點, 在沿海灘涂具有廣闊的養殖發展前景。有關青蛤的繁殖和發育的研究已經見諸報道, 如曾志南等[4～6]對青蛤的繁殖周期、卵母細胞發育過程及精細胞分化等進行了研究; 高悅勉等[7]用掃描電鏡和透射電鏡觀察了青蛤精子的形態和超微結構; 孫晉廷等[2]、沈寶平等[8]用普通光鏡對青蛤胚胎發育過程進行了觀察和描述; 白胡木吉力圖等[9]用常規石蠟切片方法對青蛤卵子的受精和第一次卵裂過程進行了研究。然而, 目前青蛤的規模化人工育苗技術并不穩定, 許多受精和發育機理尚不清楚, 亟需開展大量深入的基礎研究。本實驗采用熒光顯微術對青蛤受精及早期胚胎發育過程中的成熟分裂、雌雄原核結合、早期卵裂等一系列細胞學事件進行了研究和探討, 以期為青蛤受精機制的深入研究、規模化人工育苗以及細胞工程育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2009年6～7月在浙江省海洋水產養殖研究所清江科研基地進行。所用青蛤親貝取自臺州溫嶺, 殼高5～7 cm。熒光染色試劑盒Hoechst 33258（包括固定液、Hoechst熒光染料、抗淬滅劑）購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

選擇性腺飽滿的青蛤親貝, 雌性卵巢呈粉紅色,雄性精巢呈乳白色或乳黃色。采用陰干、流水刺激結合升溫的方法催產, 分別挑出剛產的雌、雄個體,經淡水沖洗后單個放入1 L的燒杯中, 加入600 mL過濾海水, 讓其產卵、排精。選擇鏡檢質量好的精、卵, 在水溫25～26℃條件下進行人工授精和孵化。

從受精開始, 60 min內每隔 5 min取樣一次,60～120 min, 每隔 10 min取樣一次, 每次取卵量不少于1 000粒。樣品用4%多聚甲醛溶液固定2次, 保存于4℃冰箱中。觀察前先用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）沖洗樣品2～3次, 滴加Hoechst 33258熒光染料在黑暗環境下染色10 min, 再用磷酸緩沖液沖洗2次, 然后將卵液滴于載玻片上, 加1滴抗淬滅劑, 用蓋玻片輕微壓片, 在Nikon 80i熒光顯微鏡的紫外光（365 nm）下觀察, CCD（Charge Coupled Device, 電荷耦合元件）圖像采集系統拍照, 每個樣品觀察卵數為100粒。

實驗重復3次。

2 結果

2.1 精卵形態和精子入卵

在熒光顯微鏡下, 青蛤成熟未受精卵呈圓球形,卵徑 80～90 μm, 卵質被染成淺藍色, 染色體呈亮藍色, 此時核相處于第一次成熟分裂中期, 雙價染色體粗短明顯（圖 1-1）。精子則僅能觀察到頭部濃縮的染色質發出亮藍色熒光, 呈辣椒狀, 約 3 μm 長（圖1-2）。

在水溫 25～26℃、pH8.0～8.2的條件下進行人工授精, 嚴格控制精卵比例。精、卵混合后, 精子迅速附著于卵子表面, 并逐漸斜插入卵膜, 入卵部位隨機（圖1-3）。受精后5 min左右, 精子的頭部已經進入卵胞質中, 并明顯膨大成直徑5～6 μm的近球形結構（圖 1-4）。

2.2 兩次成熟分裂

精子入卵啟動成熟分裂, 在受精后 10～15 min,受精卵進行第一次成熟分裂, 同源染色體在紡錘絲的牽拉下逐漸分開, 一組被拉向卵膜, 另一組拉向卵子中央（圖1-5, 6）。靠卵膜的那組染色體逐漸向卵膜外拱, 最后經濃縮被排出卵膜之外, 形成第一極體, 從而完成第一次成熟分裂（圖 1-7）。受精后20～25min, 留于卵內的那組染色體重新排列于赤道板上, 然后以同樣的方式在第一極體下方發生第二次成熟分裂, 姐妹染色單體分離, 產生第二極體（圖

1-8, 9）。

2.3 雌、雄原核的形成與結合

第二次成熟分裂完成以后, 卵子染色體開始膨脹擴散, 逐漸形成一團由核膜包圍的、松散的染色質,即為雌原核。在此同時, 精核也發生第二次膨脹, 形成與雌原核大小、形狀相似的雄原核。一般雌原核的位置靠近極體, 依此可區分雌、雄原核（圖 1-9）。受精后 30 min左右, 多數雌雄原核體積達到最大,呈直徑 13 μm×16 μm的橢圓形結構（圖 1-10）。

雌、雄原核形成以后, 均向卵子中央遷移（圖1-11）。受精后35 min, 兩原核在卵子中央靠近, 但仍可看到中間的核膜（圖 1-12）。隨后二者的核膜破裂,染色質凝縮成兩組染色體, 在卵子中央合并, 雌、雄原核以原核聯合方式的結合（圖 1-13～15）。聯合核的染色體整齊地排列在與卵軸垂直的紡錘體的赤道板上, 形成有絲分裂的中期分裂相, 第一次卵裂行將開始（圖 1-16, 17）。

2.4 早期卵裂

受精后40～45 min, 紡錘體微管將染色體拉向兩極（圖 1-18, 19）; 隨著核分裂的進行, 卵細胞的外形在橫向上被拉長, 然后自極體處發生縱向內縊, 形成十分明顯的分裂溝, 將卵細胞分割成 2個大小不等的分裂球（圖 1-20, 21）。第一次卵裂結束后, 兩個分裂球中的染色體又變為染色質, 核膜重建, 進入有絲分裂的間期（圖1-21）。

受精后50 min左右, 兩個卵裂球中的染色體細絲逐漸螺旋變粗, 形成清晰可見的染色體, 核膜破裂, 染色體排列于紡錘體的赤道板上, 形成第二次有絲分裂中期的核相, 第二次卵裂開始（圖 1-22～25）。第二次卵裂與第一次卵裂過程基本相同, 在與第一次卵裂垂直的縱軸方向上發生不等全裂, 其中大卵裂球的染色體分裂速度較快（圖 1-26～28）。結果在受精后55～60 min, 卵裂基本結束, 形成3小1大4個卵裂球（圖 1-29）。受精后 70 min左右, 胚胎開始第三次卵裂, 大卵裂球的染色體仍分裂較早（圖 1-30～32）。

2.5 多精入卵與染色體異常分離

在受精后 10～15 min, 發現了約 1%的多精入卵現象, 入卵的精核都能解凝縮膨脹, 膨脹大小與單精入卵精核沒有差別（圖1-33）。受精后30 min左右,觀察到大多數多精受精的卵子僅排出一個極體, 精核亦能發生原核化（圖1-34）, 這表明青蛤多精入卵可以抑制成熟分裂進程, 而對精核的原核化過程沒有太大影響。在隨后的發育中, 雖然多個雄原核能與雌原核進行染色體聯合, 但在第一次卵裂的核分裂過程中, 常因染色體不能均等分離而導致受精卵發育的失敗（圖1-35）。

圖1 青蛤受精和早期卵裂過程中核相變化的熒光顯微鏡觀察Fig. 1 Cytological observation of nuclear behavior of fertilization and early cleavage ofCyclina sinensisunder fluorescent microscope

3 討論

3.1 成熟卵母細胞所處的發育時期和雌雄原核的結合方式

在水生動物中, 不同種類成熟未受精卵所處的發育時期不盡相同。海膽的成熟卵子已排出兩個極體, 完成兩次成熟分裂; 魚類、兩棲類的成熟卵已排出一個極體, 處于第二次成熟分裂中期; 甲殼動物及多數昆蟲的成熟卵尚未排出極體, 處于第一次成熟分裂中期; 而雙殼貝類卵子的成熟分裂還未開始,處于第一次成熟分裂的前期或中期。大多數雙殼貝類如合浦珠母貝（Pinctada martensii）[10]、櫛孔扇貝（Chlamys farrer）i[11]、泥蚶（Tegillarca granosa）[12]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）[13]、文蛤（Meretrix meretrix）[14]等受精前的卵母細胞核相處于第一次成熟分裂中期, 生發泡已經破裂, 粗短的雙價染色體排列在紡錘體赤道板上, 而大西洋浪蛤（Spisula solidissima）[15]、近江牡蠣（Ostrea rivularis）[16]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[17]、寬殼全海筍（Barnea dilatata）[18]等少數貝類受精前的卵母細胞處于第一次成熟分裂前期, 生發泡尚存在, 經過精子入卵的刺激后, 生發泡破裂并啟動第一次成熟分裂。本實驗觀察到青蛤的成熟未受精卵呈圓球形, 生發泡已經破裂, 同源染色體形態清晰, 核相處于第一次成熟分裂中期, 與櫛孔扇貝、文蛤等大多數雙殼貝類相同。

貝類雌、雄原核的結合方式有原核聯合和原核融合兩種。一般認為, 受精前已完成成熟分裂的卵子,其兩性原核以融合的方式結合; 而受精前尚未完成成熟分裂的卵子, 在受精后父本的染色體組需在卵內等待卵子完成成熟分裂, 雌雄原核在卵內重新出現后, 才各自獨立形成染色體組, 以嵌合或聯合的方式完成兩性原核的結合[12]。已有的研究表明, 大多數雙殼貝類如合浦珠母貝[10]、近江牡蠣[16]、太平洋牡蠣[17]、泥蚶[12]、菲律賓蛤仔[13]、文蛤[14]、寬殼全海筍[18]等受精前尚未完成成熟分裂, 雌、雄原核均以原核聯合的方式結合, 即雌、雄原核相互靠攏時核膜不融合, 而以指狀形式相嵌, 隨后兩原核都形成各自的染色體組, 待原核核膜消失后, 兩組染色體聯合起來形成合子染色體組。僅有櫛孔扇貝等少數貝類雌、雄原核相互靠近后核膜融合, 染色質合并形成合子核。白胡木吉力圖等[9]對青蛤受精卵的組織切片觀察認為, 青蛤雌、雄原核融合成合子核, 以染色質融合的方式結合。然而, 由于組織切片技術方法的限制, 僅能對受精卵某一切面的核相進行觀察, 難以觀察到同時經過雌、雄原核的切面, 所以較難確定雌、雄原核的結合方式。相比之下, 熒光顯微術能對整個受精卵的染色質變化進行多維觀察, 有利于研究雌、雄原核的結合過程。本研究的結果發現, 青蛤的雌、雄原核在相互靠近、結合時仍然清晰可辨, 核膜不相互融合, 直到兩原核都形成各自的染色體組,證明了其結合方式為原核聯合。

3.2 貝類多精受精的主要成因和發生機理

貝類在正常受精的情況下, 一般為單精入卵、單精受精, 不僅可為卵子帶來單倍體的遺傳物質保持物種正常二倍體的細胞核, 而且還帶入有絲分裂所必需的中心粒。然而, 在已有細胞遺傳學研究的貝類中幾乎都存在多精入卵現象[11～14,16～21], 其形成原因十分復雜, 可能與不同物種、精卵的成熟度、精卵比例等關系密切, 如鮑卵對多精受精的抵抗能力較強,即使精卵比例增加到 6.6×1041, 多精受精現象也沒有增加[20]; 泥蚶卵對多精受精比較敏感, 精卵比例由2×1021上升到1×1031時, 多精入卵數明顯增加, 畸形胚胎率和 D形幼蟲率具有極顯著的差異,達到2×1041時, D形幼蟲率下降到1～4%; 利用太平洋牡蠣剛從卵巢中取出的卵子受精要比在海水中浸泡1 h后的卵子受精獲得的多精入卵數多得多[19]。另外, 多精入卵還與受精時的環境條件如水溫、pH等有關, 如近江牡蠣卵在受精時, 水溫 25℃組的多精入卵現象明顯比28.8℃組多[16]。由此可見, 在貝類人工育苗過程中要防止多精入卵和提高卵子的孵化率, 既要獲得成熟度適宜的精卵并控制精卵比例,還要創造良好的外界受精條件。

海洋無脊椎動物阻止多精受精的策略通常有三:（1）阻止精、卵質膜融合; （2）改變卵膜結構, 阻止精子的附著或穿透; （3）即使造成多精入卵, 僅有1個精核與卵核融合[16]。海膽阻止多精入卵的機制主要包括:（1）快封閉反應: 精子進入卵細胞迅速觸發膜電位改變, 引起膜外精子與卵細胞識別和融合障礙; （2）慢封閉反應: 通過皮層反應形成厚而硬的受精膜, 防范多余精子入卵[22]。然而, 對貝類阻止多精入卵的機制還不太清楚, 孫振興等[23]推測皺紋盤鮑（Haliotis discus hainai）受精時也是通過卵膜電位的變化阻止早期入卵精子和皮層反應使后期到達精子失去活力。但有些貝類阻滯多精入卵的機制相對簡單和不完善, 如扇貝的卵黃膜薄, 其外無膠膜層, 卵黃膜舉起形成受精膜時, 結構和厚度基本無變化, 故不能有效阻止多精入卵的發生[24]。在青蛤的受精過程中,也發現了極少量的多精入卵現象, 至于其主要通過何種途徑阻止多精入卵, 尚待開展進一步研究。

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Received: Mar., 24, 2010

Key words:Cyclina sinensis; fertilization; early cleavage; polyspermy; cytological observation

Abstract:The artificial insemination experiment ofCyclina sinensiswas carried out three times at Qingjiang Field Research Station of Zhejiang Mari-culture Research Institute from June to July in 2009. More than 1000 fertilized eggs and early embryos ofC. sinensisin every developmental stage were fixed by 4% paraformaldehyde and stained by Hoechst 33258 to study the changes of nuclear behavior under the fluorescence microscope. The results of cytological observation indicated that unfertilized mature eggs ofC. sinensiswere globular （80～90 μm in diameter） and remained at the metaphase of the first maturation division. At water temperature of 25～26℃, artificial insemination was conducted. After mixing of sperms and eggs, sperms quickly attached to the surface of the eggs.At 5～10 min after fertilization, sperm has penetrated into cytoplasm of egg and activated the maturation division.The fertilized eggs released the first polar body at 10～15 min and the second polar body at 20～25 min. At about 30 min, sperm nucleus and the haploid female nucleus expanded to their maximum and developed into the male and female pronuclei which were loose and incompact. At 35 min, the male and female pronuclei matched into an association nucleus after their chromosomes formed in the center of egg. Subsequently, the chromosomes of association nucleus arranged on the metaphase plate of first cleavage. At 40～45 min, the chromosomes were separated equally into two daughter cells which were different in size. At 55～60 min, the second cleavage finished and formed four daughter cells, one big and three small. The process of the second cleavage was fundamentally similar to the first cleavage. At about 70min, the third cleavage started. In addition, the abnormal polyspermy about 1% in the process of fertilization was also observed. Though the polyspermy did not affect the formation of male pronucleus, it significantly affected the process of the maturation division and mitotic division as result of abnormal chromosome division.

（本文編輯:梁德海）

Cytological change of nuclear behaviors of fertilization and early cleavage in Cyclina sinensis

DONG Ying-hui1, CHEN Jie1, LIN Zhi-hua1, HU Li-hua2, SUN Chang-sen3
（1. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China;2. Zhejiang Mari-culture Research Institute, Wenzhou 325005, China; 3. College of Life Sciences, Taizhou University, Linhai 317000, China）

S917.4

A

1000-3096（2010）12-0040-06

2010-03-24;

2010-07-15

浙江省科技廳面上農業項目（2009C32020）; 浙江省自然科學基金項目（Y3090007）; 臺州市科技計劃項目（08KY07）

董迎輝（1980-）, 男, 河南洛陽人, 博士生, 研究方向為海洋貝類發育生物學和遺傳育種學, E-mail: dongyinghui118@126.com; 林志華,通信作者, 博士, 研究員, 主要從事海洋經濟貝類遺傳育種研究, E-mail:zhihua9988@126.com