細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷中的作用

赫 曼，柴 琛，曹 農，劉永永，王斌生，俞永江

（1.甘肅省人民醫院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第二醫院普外科，甘肅 蘭州 730000）

細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷中的作用

赫 曼1，柴 琛2，曹 農2，劉永永3，王斌生2，俞永江2

（1.甘肅省人民醫院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第二醫院普外科，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷中的作用。方法 成年Wistar大鼠60只，隨機分為4組：（1）陰性對照組（C組）：開腹后僅翻動胰腺組織；（2）重癥急性胰腺炎組（S組）：3.5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型；（3）腹腔灌洗組（W組）：復制重癥急性胰腺炎（SAP）模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，生理鹽水行腹腔持續灌洗；（4）腹腔注射組（E組）：取S組大鼠的胰腺勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內注射。于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織檢測細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-1β；對胰腺及肺組織進行病理評分。結果 S組及E組肺泡間質水腫、出血，并有中性粒細胞、巨噬細胞浸潤。在不同時相，S組、W組和E組NF-κB、TNF-α、IL-1β均高于C組（P＜0.01），W組升高的幅度小于S組（P＜0.05）。結論 重癥急性胰腺炎相關性腹水可以導致急性肺損傷，肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β表達增加，提示這些因子參與急性肺損傷的發生過程，原因可能與相關性腹水激活單核-巨噬細胞有關。早期腹腔灌洗將SAP相關性腹水進行稀釋并引出體外，減少單核-巨噬細胞的活化，下調NF-κB、TNF-α、IL-1β，減輕肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

細胞因子；重癥急性胰腺炎相關性腹水；急性肺損傷；腹腔灌洗

重癥急性胰腺炎（SAP）相關性急性肺損傷是患者早期死亡的主要原因。在發病過程中，多種細胞因子活化后形成瀑布樣反應造成組織和器官的損傷。腹腔灌洗治療在臨床上常能取得較好療效[1]，但其分子生物學機制并不清楚。本文就腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷過程中細胞因子的作用機制進行探討。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

成年Wistar大鼠60只，體重250～300克，清潔級，將其隨機分為陰性對照組、重癥急性胰腺炎組、腹腔灌洗組、腹腔注射組，每組15只，雌雄不限。

1.2 主要實驗試劑與儀器

牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司生產），髓過氧化物酶試劑盒（南京建成生物工程公司生產），全自動PCR儀（上海復生生物工程研究所有限公司生產），Olympus BX-4顯微照相系統（日本Olympus公司生產），TNF-α試劑盒（武漢博士德公司生產），IL-1β試劑盒（武漢博士德公司生產），NF-κB引物（上海生工生物工程有限公司生產），RT-PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司生產）。

2 方法

2.1 模型復制

2.1.1 陰性對照組（C組）開腹后僅翻動胰腺組織。

2.1.2 重癥急性胰腺炎組（S組） 3.5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型。

2.1.3 腹腔灌洗組（W組） 復制SAP模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，以生理鹽水行腹腔持續灌洗。

2.1.4 腹腔注射組（E組）取SAP模型大鼠的胰腺組織勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內注射。

2.2 標本采集

于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織1 g，放入凍存管置液氮中冷凍后轉移至-80℃冰箱保存，待RT-PCR檢測。另取部分胰腺和肺組織以4%甲醛固定后行鏡下評分，并行肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）免疫組化檢測。

2.3 RT-PCR檢測肺組織核因子-κB（NF-κB）mRNA的表達

引物序列如下[2]：NF-κBp65上游引物：5′-ACGATCTGTTTCC－CCTCATC-3′，下游引物：5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′（221 bp）；內參照β-actin上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAGGGT-3′，下游引物：5′-CAGTGAGGCCAGGATAGAGC-3′（526 bp）。RT-PCR反應體系：反轉錄 37℃ 30 min，預變性94℃ 2 min，變性94℃15 min，退火55℃30 min，延伸72℃ 30 min，共35個循環。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2.4 TNF-α、IL-1β的檢測

采用免疫組化SP法檢測TNF-α、IL-1β，按試劑盒說明進行。工作濃度為1∶200，以PBS緩沖液代替一抗作為對照。凡胞漿、胞核內出現棕黃色顆粒的細胞定為陽性細胞，綜合陽性表達強度及細胞數（陽性率）評價陽性結果。高倍視野下隨機選取10個視野，用BI-2000醫學圖像分析系統分析其灰度值以表示陽性強度。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 各組動物死亡率和造模成功率比較

C組大鼠無死亡；S組死亡1例（6.7%），按Schmidt評分標準[2]，SAP13例（86.7%），發生肺損傷12例[3]（80.0%）；W組死亡1例（6.7%），SAP12例（80.0%），發生肺損傷11例（73.3%）；E組大鼠無死亡，SAP 5例（33.3%），發生肺損傷11例（73.3%）。S組大鼠胰腺在鏡下表現為間質水腫、炎性細胞浸潤、組織灶性出血壞死及皂化斑形成，E組表現為充血、水腫，罕見出血；S組、W組及E組肺間質水腫、出血，并有炎性細胞浸潤。

3.2 肺組織NF-κB mRNA、TNF-α和IL-1β表達變化

在不同時相，S組、E 組的肺組織 NF-κB mRNA、TNF-α 和IL-1β表達比C組均有明顯增加，S組與E組相比無明顯變化（見表1、圖1、表2、圖2、表3、圖3）。

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達（±s）

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

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圖1 各組肺組織NF-κB mRNA的表達情況

表2 不同時相各組TNF-α的表達情況（±s）

表2 不同時相各組TNF-α的表達情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

65.3±2.570.4±1.358.0±3.2201.6±3.6*△144.3±3.0*194.5±3.1*組別 3 h 6 h 12 h C組S組W組E組156.8±3.6*△102.6±1.9*147.5±2.6*184.7±2.4*△135.5±3.4*176.4±1.9*

圖2 腹腔注射組6 h肺組織TNF-α的表達情況（×200）

表3 不同時相各組IL-1β的表達情況（±s）

表3 不同時相各組IL-1β的表達情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

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圖3 重癥急性胰腺炎組6 h肺組織IL-1β的表達情況（×400）

4 討論

發生SAP時含有細胞因子的血性腹水經腹膜吸收后導致急性肺損傷及ARDS。在SAP早期進行腹腔灌洗可以減輕器官損害，本文旨在探討細胞因子在腹腔灌洗治療SAP相關性急性肺損傷中的作用機制。

4.1 SAP相關性腹水（PAAF）誘導肺損傷模型的建立

PAAF經腹膜吸收后可以誘發全身多臟器損害[4]。本研究發現，S組胰腺組織存在不同程度的間質水腫、炎性細胞浸潤、胰腺組織灶性或片狀出血壞死及皂化斑形成，伴有血性腹水，呈典型的SAP病理改變[5]。由PAAF誘發的胰腺病變程度較輕，僅有部分腺體組織水腫，少量炎性細胞浸潤。大鼠腹腔注射PAAF后誘發了肺損傷，肺臟表現為肺間質水腫及出血、肺泡間隔增寬，部分肺泡融合或萎縮，肺間質中大量中性粒細胞浸潤及巨噬細胞浸潤，部分小支氣管上皮細胞脫落，可見微血栓。其病理改變與相關報道一致[6]。

4.2 重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷（APALI）的發生機制

已有研究表明，胰酶在SAP相關性肺損傷中起非常重要的作用[7～8]。除此以外，細胞因子被激活后形成的復雜網絡導致器官的進一步損害。

4.2.1 NF-κB致肺損傷的作用機制 NF-κB活化是眾多炎癥介質作用的共同通道[9]。炎癥反應過程中，NF-κB被激活后由胞漿進入核內，與其靶基因上的啟動子或增強子結合，進而調控多種細胞因子和免疫介質的表達，進一步促發炎癥反應。

本實驗顯示，陰性對照組肺臟組織中NF-κB mRNA呈低表達；在大鼠腹腔注射SAP相關性腹水后，肺組織NF-κB mRNA的表達逐漸增強，與陰性對照組相比有顯著性差異。證實SAP相關性腹水通過腹膜吸收后激活了單核-巨噬細胞，使NF-κB活化而造成肺損傷。腹腔灌洗后，NF-κB mRNA的表達下調。近年的實驗研究也提示[10～12]，急性重癥胰腺炎時有NF-κB活化及其調控的細胞因子及趨化因子基因表達的增加。阻斷NF-κB激活通路上的某個環節有可能成為治療SAP的重要手段。除了本實驗中的腹腔灌洗外，NF-κB可以被TNF-α抗體、血小板活化因子（PAF）拮抗劑及抗中性粒細胞血清等不同程度地抑制，從而降低血清淀粉酶活性，減輕胰腺組織水腫和肺損傷的程度[13]。

4.2.2 TNF-α致肺損傷的作用機制 TNF-α是由單核-巨噬細胞、T細胞和肥大細胞等產生的一種細胞因子，是免疫的重要介質。本研究發現：在不同時相，重癥急性胰腺炎組、腹腔注射組肺組織TNF-α的表達水平均高于陰性對照組，與其受損害程度相一致，提示TNF-α在SAP的發生發展中起重要作用。同時腹腔注射組TNF-α的高表達也說明了TNF-α是SAP相關性腹水造成肺損傷的因素之一。經過腹腔灌洗后，TNF-α的表達下降，肺損傷程度減輕。TNF-α是胰腺炎時最早升高的細胞因子，它與SAP的嚴重程度密切相關，是判斷SAP嚴重程度和預后的重要指標[14～15]。應用可溶性TNF受體可阻斷TNF表達，顯著降低胰腺組織水腫，下調血清淀粉酶、脂肪酶水平，并能顯著降低實驗動物的死亡率[16]。TNF-α可以激活中性粒細胞等炎癥細胞使后者釋放大量介質造成組織損傷；激活其他細胞因子如IL-1、IL-6等形成炎癥瀑布反應，進一步加重組織損傷；增加肺血管通透性，使肺間質水腫，促使ARDS的發生[17]。

4.2.3 IL-1β致肺損傷的作用機制 IL-1β與SAP關系密切，主要由單核-巨噬細胞產生。IL-1β可直接刺激胰酶的產生和誘發其他促炎細胞因子的產生，激活中性粒細胞造成多器官功能衰竭。本研究結果顯示：在正常大鼠腹腔注射SAP相關性腹水的早期，IL-1β的表達就有所升高；在不同時相，IL-1β的表達均高于陰性對照組，與肺損傷的嚴重程度相一致。腹腔灌洗后，IL-1β的表達下調。為拮抗IL-1β對器官的損害，有學者發現給予大劑量IL-1受體拮抗劑后能明顯降低SAP實驗動物的病死率，減少中性粒細胞在肺中的積聚，減輕肺損傷的程度[18～19]。

4.3 腹腔灌洗的治療作用

SAP相關性腹水含有胰酶等大量的毒性物質、血管活性物質及蛋白質分解產物，這些物質通過腹膜不斷吸收后過度激活炎性細胞，使炎性細胞釋放大量的細胞因子及炎性介質[20]，促使全身炎性反應綜合癥的發生。因此，在早期進行持續腹腔灌洗可阻斷炎性因子經腹膜吸收途徑，降低病死率，減少并發癥的發生[21～22]。本研究發現：經過腹腔灌洗后，血清中細胞因子水平下調，減輕了肺損傷。Ranson[23]在1990年的隨機對照研究中認為長時間腹腔灌洗不僅可以減少肺部的并發癥，而且可以降低胰腺壞死組織感染的并發癥及相關的病死率。

綜上所述，重癥急性胰腺炎相關性腹水經腹膜吸收后可以導致肺損傷，NF-κB、TNF-α、IL-1β表達升高提示其參與了急性肺損傷的發生過程，原因可能與重癥急性胰腺炎相關性腹水激活了單核-巨噬細胞有關。早期腹腔灌洗將重癥急性胰腺炎相關性腹水進行稀釋并引出體外，減少了腹膜單核-巨噬細胞的活化，降低了細胞因子的表達水平，減輕了肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

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G424.31

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1671-1246（2010）14-0136-04

甘肅省科技攻關計劃項目（0709TCYA057）