實時熒光PCR和常規PCR方法檢測飼料中雞源性成分

劉彥泓 穆 春 孫 屏 楊 滴 劉岑杰 夏元鳳 徐建平

瘋牛病、禽流感等大規模傳染性疾病的肆虐和蔓延,給全世界帶來了巨大的災難。流行病學證明瘋牛病、羊癢病和人的克雅氏病、庫魯病都是由該變性蛋白質通過食物鏈傳播而引起的,因此,動物源性飼料的大規模應用,存在很多不安全的因素。為了徹底切斷瘋牛病的傳播途徑,2000年歐盟禁止生產和使用動物源性飼料,隨后世界上很多國家都將飼料中含有動物源性成分列為主要檢疫范圍,包括牛、羊源性，禽源性成分等動物源性成分,嚴禁含有禽源性等成分的飼料進口[1]。作為農業大國,我國必須加強對動物源性飼料的監管,嚴格檢驗檢疫銷售和使用的飼料。因此,急需建立能夠快速、準確鑒別檢測飼料中雞源性成分的方法。本研究采用常規PCR方法和實時熒光PCR方法檢測飼料中雞源性成分,方法的靈敏度高,實用性強,適用于雞源性成分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

生雞肉購自大連市場。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒：Promega公司的Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒。實時熒光PCR反應試劑盒(Premix Ex TaqTM)、10×PCR緩沖液/dNTP溶液、ExTaqDNA聚合酶、100 bp Maker(片段大小分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 500 bp)均購自TaKaRa大連寶生物公司。

1.3 儀器

低溫高速離心機（Eppendorf）、恒溫水浴箱、實時熒光 PCR 儀（ABI7000）、PCR 儀（ABI2700）、生物安全柜（蘇凈安泰）。

1.4 引物及探針序列

引物合成及探針合成、標記購自TaKaRa大連寶生物公司，實時熒光PCR引物序列及探針的序列見表1；常規PCR引物序列及擴增長度見表2。

1.5 模板DNA的提取

表1 實時熒光PCR引物序列及擴增長度

采用Promega公司的Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒，按照產品說明書進行。

1.6 實時熒光PCR檢測

實時熒光 PCR擴增反應具體條件：95℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，40 個循環。

表3 實時熒光PCR擴增反應體系

1.7 常規PCR檢測

PCR 反應體系：10×PCR 緩沖液 2 μl；dNTP（各 2.5 mmol/l）2 μl;上下游引物(10 000 nM)各 1 μl；ExTaqDNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl；DNA 模板(200～500 ng)2 μl;ddH2O加至25 μl。PCR反應條件:94℃變性3 min;94℃ 60 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；30 個循環；72 ℃延伸 5 min。PCR擴增產物的凝膠電泳檢測：制備2%的瓊脂糖凝膠，取 PCR 擴增產物 5 μl與 1 μl（6×）加樣緩沖液混勻，用1×TAE電泳液進行凝膠電泳分析，用100 bp Ladder DNA Marker作分子量標記，攝影并記錄。

1.8 特異性檢測

采用提取的牛、羊、豬、馬、狗、魚、大豆、玉米的DNA作為對照，與提取的雞肉的基因組DNA同時進行實時熒光PCR和常規PCR擴增。

1.9 靈敏度檢測

將雞肉粉混入豬肉粉，使其含量達到1%，對于含量在1%以下的樣品，將提取的1%含量的雞DNA溶液進行連續10倍稀釋，使其含量達到相當于實際樣品雞肉粉含量的 0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%，然后進行實時熒光PCR和常規PCR擴增。

1.1 0 飼料樣品的檢測

選取寵物食品、雞血飼料、雞骨粉、雞羽毛粉，提取其DNA，與提取的雞肉的基因組DNA同時進行實時熒光PCR和常規PCR擴增。

2 結果及分析

2.1 特異性檢測結果

實時熒光PCR對幾種動植物的DNA擴增，結果只有雞被檢測出，形成擴增曲線，其他則沒有特異性擴增曲線，表明本研究所選取的DNA片段特異性比較強，結果見圖1。常規PCR擴增結果也顯示同樣的特異性。

2.2 靈敏度檢測結果

通過對不同含量的雞基因組DNA模板進行PCR檢測，得到實時熒光PCR的檢出限為0.001%，結果如圖2所示。本研究的檢出限比金凌艷等[2]實時PCR檢測牛羊源性成分的方法檢出限低，這可能與基因組DNA的提取質量有關。

對于常規PCR，當含量達到0.1%時，電泳條帶較暗，含量達到0.01%時沒有條帶，如圖3所示（第2、3、4泳道）。說明常規PCR能夠檢出的最低含量為0.1%，這與潘良文、張舒亞等[3-4]的研究結論相同。

圖3 常規PCR靈敏度檢測結果

2.3 檢測飼料樣品的結果

對不同飼料進行實時熒光PCR和常規PCR檢測，結果如圖4、圖5所示。說明幾種飼料中含有雞源性成分，一種寵物食品中不含有雞源性成分。

3 討論

本研究選擇雞線粒體DNA作為對象，根據Genbank中提供的基因序列，設計并優化了針對雞的特異性引物及探針。線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質，基因組中無間隔系列，無組織特異性，種內遺傳穩定，種間高度變異，個體中不同組織線粒體DNA高度均一[5-6]，可以獲得較高的拷貝數，易于檢測。目前，線粒體DNA序列已經廣泛應用于研究物種的遺傳分化、群體遺傳結構、物種進化、飼料成分監督等[7-8]。

在飼料加工過程中，原料通常需要經過高溫干燥、油炸、粉碎等高強度處理，會造成DNA分子的斷裂及損失，在一定程度上增加了PCR檢測的難度。本研究設計的常規PCR檢測目的片段長度為161 bp，既可以滿足實驗需要，又保證了實驗結果的準確性。

實時熒光PCR技術相當于定性PCR與分子雜交的結合，它能區別只有少數堿基差異的DNA序列，具有高特異性和高精確性的優點[9]。而且實時熒光PCR是在封閉的體系中進行，反應結束無需進行電泳，避免污染和危害，縮短了檢測時間。通過對市售飼料樣品和送檢骨粉樣品的檢驗發現，10份飼料有4種檢出含有雞源性成分，6份油炸骨粉中1種標明豬骨粉中檢出雞源性成分，進一步證明本研究所建立的常規PCR和實時熒光PCR檢測方法的準確性和可靠性，可以作為雞源性成分的常規檢驗方法。

[1]潘良文，陳家華.食品和飼料中動物源性成分的檢測方法的進展[J].檢驗檢疫科學,2002(2):45-47.

[2]金凌艷，顧欣，蔡金華,等.應用兩種PCR方法檢測飼料中牛、羊源性成分[J].中國農業科技導報,2008(10):76-80.

[3]潘良文，陳家華，丁燕,等.進口肉骨粉中牛成分檢測研究[J].生物技術通報,2001(5):23-26.

[4]張舒亞，管薇薇，劉月明,等.飼料中魚源性真實性鑒別研究[J].飼料研究,2009(6):45-46,48.

[5]Anderson S,Bankier B G,Bruijn M H,et al.Sequence and organization of the human mitochondrial genome[J].Nature,1981(290):457-465.

[6]雷初,陳宏,王德,等.關于驢線粒體DNA D-Loop多態性分析[J].中國畜牧雜志,2004(4):10-12.

[7]Wolstenholme D R.Animal mitochondrial DNA:structure and evolution[J].Int.Rev.Cytol.,1992(141):173-216.

[8]Tartaglia M,Saulle E,Pestalozza S,et al Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds:a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials[J].Journal of Food Protection,1998,61(5):513-518.

[9]Heid C A,Stevens J,Livak K J,et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Research,1996(6):986-994.