復生康膠囊微生物限度檢查法方法驗證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗所,廣西南寧 530001）

復生康膠囊微生物限度檢查法方法驗證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗所,廣西南寧 530001）

目的建立復生康膠囊微生物限度檢查方法。方法 以3株細菌、2株真菌對復生康膠囊進行微生物限度檢查方法的驗證試驗。結(jié)果采用常規(guī)法大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%,枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿）的回收率達到70%以上,控制菌采用常規(guī)法進行檢驗,可檢出大腸埃希菌。結(jié)論經(jīng)驗證復生康膠囊微生物限度檢查法應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法檢查細菌;常規(guī)法檢查霉菌、酵母菌和控制菌。

復生康膠囊;微生物限度;方法驗證;回收率;培養(yǎng)基稀釋法;常規(guī)法

復生康膠囊主要成分為蒲葵子、喜樹果、莪術(shù)、柴胡、絞股藍、香菇、黃芪、甘草、磷酸氫鈣[1-3]。具有活血化瘀、健脾消積功效,用于胃癌、肝癌的治療,能增強放療、化療的療效,增強機體免疫功能,改善臨床癥狀。處方中的莪術(shù)、柴胡有一定的抑菌作用[4-5]。根據(jù)其用藥途徑、成分和制法,按照2005年版《中國藥典》一部附錄XⅢC微生物限度檢查法[6],應(yīng)進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定,及控制菌大腸埃希菌檢查,建立微生物限度檢查方法,并加以驗證。

1 儀器與試藥

1.1 實驗菌種 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、大腸埃希菌 CMCC（B）44102、白色念珠菌 CMCC（F）98001、黑曲霉 CMCC（F）98003,均由廣西食品藥品檢驗所提供。

1.2 樣品 復生康膠囊:批號:051101、060101、060102;由廣西昌弘制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）,膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基,改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基,MUG培養(yǎng)基,曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）,由廣西食品藥品檢驗所提供,按干燥培養(yǎng)基瓶簽方法配制;pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,0.9%無菌氯化鈉溶液按《中國藥典》2005年版二部附錄方法配制。

2 細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法的建立及驗證

2.1 菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物,加10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用。

2.2 供試液的制備方法 取樣品10 g,加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL,制備成溶解均勻的1∶10的供試液。

常規(guī)法:取供試液1 mL注皿。

培養(yǎng)基稀釋法:取供試液1 mL注入2個平皿中（0.5 mL/皿）。

2.3 回收率試驗 試驗組:取規(guī)定量供試液及50～100 CFU各試驗菌,分別注入同一平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,平行制備2個平皿。細菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h。

菌液組:取50～100 CFU各試驗菌注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,細菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h,測定所加入的試驗菌數(shù),平行制備2個平皿。

供試品對照組:取規(guī)定量供試液,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,細菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h,測定供試品本底菌數(shù)。

2.4 方法的確定

2.4.1 常規(guī)法 見表1。

表1 復生康膠囊常規(guī)法試驗結(jié)果 CFU/皿

從表1表明,常規(guī)法對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%,可采用常規(guī)法對復生康膠囊霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)。枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率均低于70%,表明該法進行細菌計數(shù)不可行。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 見表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿） CFU/皿

表2表明,采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿）,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率達到70%以上,故可采用該法進行細菌計數(shù)。

2.5 細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法驗證 見表3。

表3 3批復生康膠囊回收率試驗結(jié)果 %

表3表明,采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）,進行細菌微生物限度檢驗,3種試驗菌回收率均大于70%。霉菌及酵母菌計數(shù)方法為常規(guī)法,其2種規(guī)定試驗菌回收率均大于70%。方法可行。

3 控制菌檢驗方法的建立及驗證

試驗組:取1∶10供試液10 mL接種至100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基,同時加入大腸埃希菌10～100 CFU,35℃培養(yǎng)24～48 h。取培養(yǎng)物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管中,35℃培養(yǎng)24 h,360 nm紫外燈下觀察熒光,然后進行靛基質(zhì)試驗,觀察結(jié)果;另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍（EMB）平板,35℃培養(yǎng)18～24 h,觀察其菌落形態(tài)。

陰性菌對照組:取金黃色葡萄球菌作為陰性對照試驗菌,方法同試驗組。

經(jīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后,試驗組與陰性對照組相比較有明顯的變化,試驗組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象,結(jié)果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規(guī)法試驗結(jié)果

表4表明,采用常規(guī)法進行大腸埃希菌檢驗,方法成立。

4 3批復生康膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的復生康膠囊微生物限度檢查法,對3批樣品進行檢驗,細菌、霉菌及酵母菌數(shù)均小于10個/g,未檢出大腸埃希菌。

5 討論

5.1 在對藥品進行微生物限度檢查方法的驗證時,采用預(yù)試驗方法對驗證用菌株抑菌活性的強弱進行預(yù)測,可為正式試驗的方法提供依據(jù),同時可以減少工作量及試藥、試劑的浪費,提高工作效率。

5.2 由于藥品中的污染菌種類繁多,不同藥品對不同種類的細菌、霉菌的抑制作用強弱程度不同,不同藥品處方成分及其各成分的量不同等因素,對微生物的生長影響不一。復生康膠囊處方中的莪術(shù)、柴胡對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用,但抑菌活性強度不強,在常規(guī)法達不到藥典要求時,采用培養(yǎng)基稀釋法即可以使這兩種菌的試驗回收率達到70%以上。

5.3 經(jīng)實驗驗證確定復生康膠囊微生物限度檢查方法可按以下進行,培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）測定細菌數(shù),常規(guī)法測霉菌及酵母菌數(shù);采用常規(guī)法進行大腸埃希菌檢驗。

:

[1]高鵬,徐立春,陳平,等.莪術(shù)醇生物構(gòu)建自體瘤苗治療晚期胃癌患者近期療效研究[J].吉林中醫(yī)藥.2008,28（1）:54-58.

[2]李鴻燕.小柴胡湯為主治療慢性萎縮性胃炎86例臨床觀察[J].吉林中醫(yī)藥,2006,26（1）:20.

[3]宗秀芝,于晶.黃芪治療心血管疾病的作用機理[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28（8）:601.

[4]袁長津,盧芳國,朱應(yīng)武.小柴胡湯及其加減方體外抗菌作用的實驗研究[J].中醫(yī)藥導報,2005,11（10）:54-55.

[5]魏玉平,駱志成.莪術(shù)揮發(fā)油體外抗念珠菌活性的研究[J].中國麻風皮膚病雜志,2005,21（7）:524-526.

[6]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].2005:附錄XⅢC:70-77.

R282

A

1007-4813（2010）01-0131-02

顏棟林（1970-）,男,大學本科,主管藥師。研究方向:食品藥品標準研究。

（

2009-10-15）