電針對模型大鼠海馬CA1區Aβ的陽性細胞表達和腦內SOD活性的影響

趙鳳云，關珊珊，張鵬，姜國華

(1.黑龍江省康復醫院，黑龍江 哈爾濱 150018;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)是神經系統變性疾病，以老年人為多發，是癡呆最常見的病因。以老年斑、神經元纖維纏結、海馬椎體細胞顆?？张葑冃院蜕窠浽笔榈湫筒±硖卣鳎前殡S老化而出現認知功能障礙為主的疾患。針灸對癡呆具有一定的療效，對老年癡呆患者的智能提高(改善學習記憶功能障礙)及臨床癥狀改善均有明顯的作用［1～3］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

4月齡Wistar大鼠60只(黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供)，健康清潔級，體重220～250g，鏈脲霉素(STZ)、丙二醛、超氧化物歧化酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Aβ免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物分組、造模及行為學測試

將Wistar大鼠在實驗室適應性飼養1w，然后用Morris水迷宮篩選出智力正常的60只大鼠，隨機分成空白組12只、模型對照組12只、模型組12只、西藥組12只和電針組12只。模型組、西藥組和電針組的大鼠經10%水合氯醛(3mL·kg－1)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上。常規消毒頭頂部皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜后用錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜，參照大鼠腦立體定位圖譜［1］定位側腦室:前囟后0.8mm，中線旁開1.5mm，深3.8mm。用微量注射器在每側側腦室各注射鏈脲霉素(STZ)10μL(注射前將STZ 溶于生理鹽水，濃度為 10%)［5，6］，緩慢進針，勻速給藥，10min注完，使其充分浸潤局部組織，緩慢拔出微量注射器，第3天重復注射，劑量同前。正常組不予處置，模型對照組操作同前，以等量生理鹽水替代STZ。所有術后大鼠均肌注青霉素，每只每天40萬單位，常規飼養。水迷宮行為學測試分別在術前、術后及治療后進行。①定位航行試驗:歷時5d，每天(上午7點30至下午16點)4次水迷宮測試，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在120s內找到平臺并爬上平臺的時間，即潛伏期。如果大鼠在120s內不能找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺。第1d讓大鼠在平臺上停留20s，第2d停留15s，第3d停留10s，第4天停留5s。②空間探索實驗:第5d去除平臺，任選一入水點，將大鼠放入水池中，記錄其在120s內跨過原平臺所在位置的時間。

1.3 治療及取材

正常組、模型對照組、模型組常規飼養。西藥組給與氫溴酸加蘭他敏，劑量為0.5～1mg·(kg·d)－1。電針組針刺治療，根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》，用0.25mm×25mm毫針針刺百會穴，平刺約2.5mm;大椎穴，直刺約4mm;雙側太溪穴，直刺進針3mm;雙側腎俞穴，直刺進針5mm;雙側足三里穴，直刺進針4mm。其中百會穴、大椎穴連接KWD－808Ⅱ型全能脈沖電療儀，頻率為30Hz，電壓為2V，強度以肢體輕微抖動為度;余穴間歇5min捻轉1次，平補平瀉，每日1次，時間30min，7d為1療程，間歇1天，治療4個療程后進行行為學測試。水迷宮測試完畢后，第2d每組隨機選取6只，用10%水合氯醛(4mL·kg－1)腹腔麻醉，麻醉后立即開胸暴露心臟，左心室插管，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水至肝臟顏色變白，改灌4%的多聚甲醛，快速灌注，當出現下肢抽動時，緩慢灌注30min，至肝臟變硬，四肢、尾均僵硬后停灌。取腦，放入4%的多聚甲醛溶液中固定過夜，進行石蠟包埋，HE染色，免疫組織化學染色。再將每組剩余大鼠斷頸處死取全腦，取一側腦組織，去除軟腦膜血管、腦干及小腦，用冰生理鹽水沖洗血液后，濾紙拭干，稱重，加入9倍冷生理鹽水，電動勻漿機中研磨成10%勻漿，之后以3000r·min－1的速度離心15min，取上清液，按照試劑盒說明進行生化指標的檢測。

1.4 圖像分析及統計方法

陽性細胞數的計算:取每組大鼠腦組織切片12張，每張切片于海馬區隨機選取5個區域，在400倍顯微鏡下計算此區域內的免疫組化染色為棕色的Aβ陽性細胞數。由兩名人員獨立觀察最后取平均值，結果以均數±標準差(±s)表示。計算公式:

圖像采用Image－Proplus5.0軟件進行圖像分析。各組實驗數據采用統計程序軟件SPSS 17.0進行運算，采用t檢驗，用(±s)表示。

2 結果

2.1 海馬CA1區Aβ蛋白表達

表1顯示，正常組、模型對照組CA1區Aβ蛋白有較低表達，模型組CA1區Aβ蛋白表達水平顯著升高，治療后西藥組、電針組與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組海馬CA1區Aβ蛋白表達陽性細胞數(±s)(個·mm－2)

表1 各組海馬CA1區Aβ蛋白表達陽性細胞數(±s)(個·mm－2)

注:與模型組比較，*P<0.01。

組別 n 表達陽性細胞數正常組 12 10.87±3.15*模型對照組 12 11.09±3.28*模型組 12 25.31±2.46西藥組 12 18.52±2.63*電針組 12 17.94±2.70*

2.2 電針對AD大鼠腦組織內MDA含量和SOD活性的影響 見表2，圖1。

圖1顯示:模型組與正常組、模型對照組比較，大鼠腦組織內MDA含量明顯升高(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，MDA含量明顯降低(P<0.01);模型組與正常組、模型對照組比較，SOD活性明顯降低(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，SOD活性明顯升高(P<0.01)，均有極顯著性差異。以上說明電針可以降低AD大鼠腦組織內MDA含量，而使SOD活性增強。

表2 各組大鼠腦組織內MDA含量和SOD活性(±s)

表2 各組大鼠腦組織內MDA含量和SOD活性(±s)

注:與模型組比較，*P<0.01;與正常組、模型對照組比較，#P<0.01;與西藥組比較，▲P>0.05。

組別 n MDA(nmol·mgprot－1) SOD(NU·mgprot－1)11 217.52±15.07 204.35±11.18模型對照組 10 219.73±14.87 201.51±12.36模型組 10 310.22±5.42# 121.25±8.27#西藥組 9 242.47±9.65* 171.31±7.71*電針組 10 268.36±11.09*▲ 168.58±10.06正常組*▲

圖1 各組大鼠腦組織內MDA含量和SOD活性比較

3 討論

AD最典型的病理改變是老年斑，而老年斑主要成分就是Aβ。聚集狀態的Aβ具有長期的穩定性，所以一旦發生聚集，很快就形成極難溶解的沉淀，在神經細胞內沉積下來。沉積的Aβ與凋亡細胞在腦內如基底核、海馬、新皮層等逐漸累積，進而導致典型的老年斑。纖維狀的Aβ產生毒性作用，導致神經元細胞的死亡，從而使AD患者出現認知功能減退與記憶礙障等癡呆癥狀。脂質過氧化的最終產物如MDA的細胞毒性作用，是導致AD神經元變性壞死的重要原因。SOD能夠阻滯由于大量過氧化氫蓄積所導致的神經元凋亡的發生，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，SOD是體內重要的自由基清除酶，能促使超氧陰離子氧化為過氧化氫，保護細胞免受損傷，衰老機體SOD活性減弱，抗氧化劑減少，自由基損傷因素增加。實驗結果顯示，模型組大鼠與正常組和模型對照組對比，可見到較多的Aβ沉積，其腦內Aβ陽性神經細胞數明顯高于正常組和模型對照組。電針治療后，電針組大鼠Aβ的陽性細胞表達明顯下降;模型組與正常組、模型對照組比較，大鼠腦組織內MDA含量明顯升高;電針組、西藥組與模型組比較，MDA含量明顯降低;模型組與正常組、模型對照組比較，SOD活性明顯降低(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，SOD活性明顯升高(P<0.01)，均有極顯著性差異。根據阿爾茨海默病臨床表現，在中醫學中將其歸屬為“癡呆”、“健忘”、“善忘”、“呆病”、“郁證”，“癲疾”等病癥范疇，針刺治療AD的原則是補腎益髓、醒神開竅。補腎益髓以治其本，醒神開竅以治其標。在上述治療原則的指導下，選取百會、大椎、腎俞、太溪和足三里穴。百會穴為督脈和足太陽膀胱經的交會穴，具醒神開竅之功，為治療老年性癡呆的主要穴位;腎俞為足太陽膀胱經穴，培補腎氣;太溪為足少陰腎經穴，補腎益精，二者為臨床補腎要穴，常用于失眠，健忘及其它神志及精神疾患;大椎出自《素問·氣府》，屬督脈經穴位，是手足六陽經的交會穴，為“諸陽之會”，可通調諸經，增強各臟腑經絡，促使陰陽平衡;足三里為足陽明胃經的合穴，是傳統保健要穴，且在《素問·玉機真臟論》指出:“五臟者，皆稟氣于胃，胃者，五臟之本也”，故而分別用來補先天之本和后天之本。諸穴相配，達到補腎益髓、醒神開竅、標本同治的目的。本實驗的結果表明，電針能夠抑制Aβ在腦內過度沉積，降低Aβ在腦內的表達，降低腦組織內MDA含量，而使SOD活性增強，從而改善了大鼠學習記憶功能。從實驗角度驗證了電針對AD的治療效果。

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