三痹湯對實驗性關節炎大鼠關節滑膜MMP-3及明膠酶-B的影響

張春芳，客蕊，汪洋，王巖，郭玉紅

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

類風濕性關節炎(RA)是一種慢性進行性的自身免疫性疾病。以關節滑膜炎及對稱性、破壞性的關節病變為主要特征。其病因及發病機制仍不清楚，但細胞因子已被公認是RA炎癥和關節損傷的重要介質，其主要的病理環節涉及免疫功能失常、關節滑膜細胞聚積與滑膜增厚、關節軟骨和骨破壞三個方面。本課題前期研究結果表明，三痹湯能降低佐劑型關節炎(AA)大鼠血清中TNF-α及IL-1表達水平，對關節炎癥進展有一定的抑制作用。本實驗進一步觀察三痹湯對AA大鼠膝關節及滑膜組織內的病理變化及關節滑膜組織內MMP-3、明膠酶-B表達的影響，結合前期研究結果，闡明三痹湯對AA大鼠膝關節及滑膜組織內類風濕因子的調控機制，以期為臨床三痹湯防治RA提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體重(180±20)g，均購自于由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，在通風、溫度及濕度適宜的動物室內常規飼養。

1.1.2 藥品與試劑 川續斷、杜仲、防風、華陰細辛等16味中藥材均購自于黑龍江省藥材公司;雷公藤多苷片(上海醫科大學紅旗制藥廠，批號:20070602，10mg/片);注射用卡介苗(上海生物制品研究所，批號20061103，75mg/支);MMP-3、明膠酶-B 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 實驗儀器與設備

YS100光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);展片儀、烤片機(中國天津愛華公司);RM2135超薄切片機德國(LEICA VLTRACUT公司);CMIA系列-多功能真彩色病理圖像分析系統(北京航空航天大學圖像中心);MK2500型足容積測量儀(日本Mukomachi Kiai CD公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備

三痹湯混懸液制備:川續斷、杜仲、防風、華陰細辛等16味中藥材3倍量的水浸泡1h后，加熱煎煮2次，第1次煎3h，第2次煎2h，2次煎煮液混合后，80℃水浴濃縮成膏，60℃干燥箱中烘干成粉末，每克粉末含生藥3.52g。將中藥粉末加蒸餾水定期配制成混懸液，濃度為20%。

雷公藤混懸液:將雷公藤多苷片研成細末，加生理鹽水，配制成混懸液(每ml含雷公藤多苷1mg)。

弗氏完全佐劑(FCA):取凍干卡介苗50mg 80℃、1h滅活后，混入高壓滅菌的液體石蠟、羊毛脂(1∶1)12.5mL，配成10g·L-1的乳劑，充分碾磨、混勻即得。

1.2.2 模型制備與分組

將60只大鼠隨機分為5組:空白對照組、模型對照組、三痹湯高劑量組、三痹湯中劑量組、雷公藤(TPT)對照組，每組12只。大鼠佐劑性關節炎(AA)的模型制備:臨用前從冰箱取出弗氏完全佐劑，充分振蕩、混勻。大鼠常規消毒后將其右后肢拉直，用1mL注射器針頭于足拓中部皮內注射，每只大鼠注射0.1mL弗氏完全佐劑。除空白對照組外，其余四組均制備AA模型，所有動物均造模成功［1］。

1.2.3 給藥方法

按人、大鼠給藥劑量體表面積折算公式計算出給藥計量。造模后第8天灌胃給藥，三痹湯高劑量組灌服中藥混懸液3.46g·(kg·d)-1，三痹湯中劑量組灌服中藥混懸液1.73g·(kg·d)-1，雷公藤組灌服雷公藤混懸液9.45mg·(kg·d)-1，模型組和空白組灌服同體積的蒸餾水。連續給藥21d。

1.2.4 足跖腫脹度的計算

分別于致炎前、給藥前、末次給藥后1h用足容積測量儀測量各組大鼠、左、右后足容積。

1.2.5 光鏡觀察關節病理變化

造模21天后處死大鼠，取雙側踝關節，4%多聚甲醛固定1周，10%EDTA脫鈣1周，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE常規染色。于光學顯微鏡下觀察病理形態學改變。

1.2.6 免疫組化檢測關節滑膜MMP-3、明膠酶-B的表達

①石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2室溫孵育5min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次，熱修復抗原后PBS(0.01md·L-1pH 7.4)洗2次，每次5min;②10%的正常山羊血清封閉，室溫下孵育10min，PBS沖洗5min;③加1∶200稀釋的一抗，37℃孵育1～2h，PBS沖洗3次，每次5min;④滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min;⑤滴加堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS沖洗3次，每次5min;⑥DAB染色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

圖像分析:隨機選取5個高倍視野(×200)，計算每個視野的陽性面積比，取其平均值。陽性面積比為每個視野陽性目標面積占整個統計面積的百分率。

1.2.8 統計學處理

2 結果

2.1 光鏡觀察關節病理變化

空白組大鼠可見滑膜組織無增生及炎性細胞浸潤，無血管翳形成，骨及軟骨結構基本正常。模型組大鼠可見滑膜組織增生，細胞明顯充血水腫、呈不規則排列，大量炎細胞浸潤，關節軟骨表面粗糙，骨部分破壞，血管翳形成并部分伸向關節腔，關節腔隙明顯縮小。雷公藤多甙組可見大鼠少量滑膜組織增生，細胞充血不明顯，排列較規則，散見炎細胞浸潤，關節軟骨面較完整，局部粗糙，血管翳形成，關節腔隙稍縮小。三痹湯高劑量組由2～3層滑膜細胞構成，細胞排列較整齊，仍可見少量炎細胞浸潤，關節軟骨及骨變化與雷公藤多甙組相當。三痹湯中劑量組可見滑膜組織輕度增生，部分細胞排列尚規整，踝關節和滑膜組織中炎性細胞明顯減少，關節軟骨破壞程度降低，關節腔隙輕度縮小，改善程度劣于高劑量組。

2.2 三痹湯對AA大鼠足跖腫脹度的影響

表1結果顯示，致炎后給藥前，與空白對照組相比，模型對照組、三痹湯高、中劑量組、TPT組大鼠左、右后足跖腫脹度明顯增高，有統計學意義(P＜0.05);與本組給藥前相比，三痹湯高、中劑量組左、右后足跖腫脹度及TPT組右后足跖腫脹度明顯減輕，有統計學意義(P＜0.05)。與給藥后模型對照組比較，三痹湯高、中劑量組及TPT組大鼠左、右足跖腫脹度明顯減輕，有統計學意義(P＜0.05)，與TPT組相比，三痹湯組高、中劑量組左、右足跖腫脹度無明顯變化，無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組對AA大鼠足趾腫脹度影響的比較(±s)

表1 各組對AA大鼠足趾腫脹度影響的比較(±s)

注:與本組給藥前比較，△P＜0.05;與模型對照組給藥后比較，*P＜0.05;與空白對照組比較，#P＜0.05。

組別n 左后足跖腫脹度 右后足跖腫脹度給藥前(%) 給藥后(%) 給藥前(%) 給藥后(%)空白對照組15 2.31±0.13 2.53±0.21 2.42 ±0.18 2.75 ±0.19模型對照組 15 7.55±1.07# 8.47±1.15 31.91 ±4.90# 28.59±3.71三痹湯高組 15 7.46±2.00# 6.77±1.90△* 31.78 ±6.10# 18.57±4.26△*三痹湯中組 15 7.61±1.13# 6.82±1.01△* 32.65±5.03# 19.66±3.28△*TPT組 15 7.50±1.60# 6.50±0.97* 31.86 ±5.70# 17.05±3.50△*

2.3 三痹湯對AA大鼠關節滑膜MMP-3的表達的影響 見表2。

表2 各組對AA大鼠滑膜組織MMP-3影響的比較(±s)

表2 各組對AA大鼠滑膜組織MMP-3影響的比較(±s)

注:空白組比較，★P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與TPT組比較，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

組別 n MMP-3陽性面積比空白對照組15 7.72±0.78模型對照組 15 14.74±3.08★三痹湯高組 15 10.77 ±2.11△#三痹湯中組 15 11.82 ±1.87△*TPT組 15 9.50 ±1.97△

由表2可見，與空白對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中MMP-3呈強陽性表達，具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，三痹湯各組、TPT組能下調AA大鼠滑膜組織MMP-3的表達，具有統計學意義(P＜0.05);與TPT組比較，三痹湯高劑量組下調AA大鼠滑膜組織MMP-3的表達程度相當，無統計學意義(P＞0.05)，三痹湯低劑量組下調的程度減低，有統計學意義(P＜0.05);提示三痹湯高、中劑量組均能降低AA鼠滑膜組織中MMP-3的表達，其中高劑量組作用較強。

2.4 三痹湯對AA大鼠關節明膠酶-B的表達的影響 見表3。

表3 各組對AA大鼠滑膜組織明膠酶-B影響的比較(±s)

表3 各組對AA大鼠滑膜組織明膠酶-B影響的比較(±s)

注:與空白組比較，★P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與TPT組比較，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

組別 n MMP-3陽性面積比空白對照組15 17.36±3.76模型對照組 15 59.70±6.53★三痹湯高組 15 27.73 ±4.53△#三痹湯中組 15 33.92 ±5.36△*TPT組 15 23.50 ±3.97△

3 討論

類風濕性關節炎(RA)是一種以關節滑膜炎癥為主要病理表現的慢性、系統性的自身免疫性關節炎疾病。其重要的病理變化為滑膜組織過度增生、關節軟骨和骨組織進行性破壞及功能障礙。近年研究發現，基質金屬蛋白酶(MMPs)的異常表達，可以直接降解軟骨和骨質，引起關節軟骨及骨的損傷，從而對關節造成破壞，參與了 RA 的發?。?，3］。MMP-3 被認為是導致軟骨降解的最重要的蛋白酶［4］。許多信息激活MMP-3后才能活化其它MMPs，是RA關節損傷的主要介質，通過降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，引起骨組織的破壞［5，6］。RA患者關節滑液及滑膜組織均有明膠酶-B的高表達，認為明膠酶-B可能是反映關節局部炎癥的標志物，通過降解明膠及存在于軟骨中的其他膠原質(如Ⅰ型膠原等)，參與關節軟骨破壞及RA進展過程［7，8］。RA關節軟骨的破壞是膠原酶、基質降解酶和明膠酶共同作用的結果［8］

佐劑性關節炎大鼠(AA)是一種目前公認的研究RA經典動物模型。被廣泛運用于研究RA的發病機理和新藥療效。本研究采用AA大鼠模型，觀察三痹湯對大鼠AA模型作用機制的影響。結果顯示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠左、右后足跖腫脹度明顯增高，滑膜組織增生，呈不規則排列，大量炎細胞侵潤，提示模型制備成功;三痹湯中、高劑量及TPT均能明顯抑制AA大鼠繼發性、自身免疫性炎癥性足腫脹，(P＜0.05)關節可見少量滑膜組織增生，排列較規則，散見炎細胞浸潤，關節軟骨面較完整，并下調AA大鼠大鼠滑膜組織MMP-3和明膠酶-B表達水平，與TPT組比較，三痹湯高劑量組療效相當，三痹湯中劑量組量低效遜，至于三痹湯中、高劑量是否有無明確的量效關系有待于進一步研究。

RA屬于中醫學痹證范疇，“痹者，閉也，三氣雜至，壅閉經絡，血氣不行，不能隨時祛散，故久而為痹?！比詼鲎杂凇秼D人大全良方》，具有補氣和血、袪風除濕、散寒止痛、益腎滋陰功效，主治由風、寒、濕三氣雜至而成之痹癥。方中四物湯補血活血，四君子湯祛邪先扶正，正氣旺則邪氣不可干;獨活、秦艽、防風驅風濕，止痹痛;杜仲、續斷、牛膝壯筋骨，補肝腎;白花蛇，穿山甲、?蟲活血通絡。三痹湯諸藥合用，散藥得補藥以行其勢，輔正驅邪，通過抑制炎性細胞因子IL-1和TNF-a過度釋放，阻斷其誘導下MMP-3、明膠酶-B高水平表達，改善滑膜細胞增生引起基質降解程度，進而減輕或延緩關節損傷［9］，使其恢復陰陽平衡狀態，既能顯著抑制免疫性炎癥又能“扶助正氣”，為臨床上應用三痹湯治療RA提供了實驗依據。與Clio等認為MMP-3可以作為RA患者滑膜損害的指標并可預測疾病的預后結果一致。

［1］ 李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.上海:上海科學技術出版社，1991:305-306.

［2］ Ishiguro N，Ito T，O bata K，et al.Determ ination of stromelysin-1，72 K da type IV collagenase，tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)，and TIMP-2 in synovial fluid and serum from patients with rheumatoid arthritis［J］.J Rheumatol，1996(23):1599-1604.

［3］ Kliniuk PA，Sierakowski S，latosiewicz R，et al.Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in differenthisto-logical variants of rheumatoid synovitis［J］.Rheumatology(Oxford)，2002(41):78-87.

［4］ Okada Y.Proteinases and matrix degradation.In Kelley WN，Ruddy S，Harris ED，eds.Textbook of theumatology［J］.Philadelphia:WB Saunders，2000(6):55-72.

［5］ 蔣明.風濕病學［M］.北京:科技出版社，1995:304-317.

［6］ Zucker S，Hymovitz M，Conner C，et al.Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in blood and tissues:clinical experimental applications.Ann NY Acad Sci，1999(878):212-227.

［7］ Lydyard PM，Edwards JC.The pathophysiology of rheumatoid ar2thritis［J］.Clin Exp Rheumatol，1994，12(11):55-58.

［8］ Fosang AJ，Neame PJ，Last K，et al.The interglobular domain of cartilage aggrecan is cleaved by PUMP，gelatinases，and cathep sin B［J］.J B iol Chem，1992(267):19470-19474.

［9］ Tsuboi H，Matsui Y，Yamane S，et al.Tartrate resistant acid phosphatase(TRAP)positive cells in rheumatoid synovium may induce the destruction of articular cartilage［J］.Annals of the Reum atic D is，2003，62(3):196-204.