腎白寧對大鼠糖尿病腎病模型細胞凋亡及對 Bax，Bcl－2 的影響

黃吉峰，金祈卓，劉麗燕，王名蓂，李顯筑 (指導)

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中西醫結合研究所，黑龍江 哈爾濱 150090)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病代謝異常引起的腎小球硬化造成腎功能損害和障礙，是糖尿病最常見而又最難治的微血管并發癥，可增加心血管事件的發生率與死亡率，是糖尿病患者致殘與死亡的重要因素之一［1］。近年來的研究表明，細胞凋亡與DN發生密切相關，為進一步揭示DN的發病機理及中藥腎白寧的作用機制，我們開展了腎白寧對DN細胞凋亡影響的研究，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 腎白寧:由哈爾濱世一堂研究所配制成浸膏(藥物組成:黃芪50g，熟地黃20g，山藥15g，山茱萸15g，牡丹皮 15g，茯苓 25g，澤瀉 15g，桑螵蛸 35g，水蛭10g，白花蛇舌草45g，當歸15g，益母草15g等);洛汀新 (貝那普利，北京諾華制藥有限公司，批號:X1266)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物 清潔級健康SD雄性大鼠(200～240g)60只。

1.2.2 糖尿病腎病模型的建立 動物適應性喂養1周后開始實驗。隨機取15只為假手術組，假手術組大鼠在腹腔麻醉狀態下，背部切口，剝離左腎脂肪包膜，關閉縫合切口。其余大鼠腹腔麻醉下進行左側腎臟切除術，術后恢復2w。將STZ溶于0.1mol·L－1檸檬酸緩沖液(pH4.4)中，避光條件下迅速配成濃度為1%STZ溶液。動物禁食12h后，按照50mg·kg－1劑量，予以STZ腹腔注射;72h后，尾靜脈取血，測定空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol·L－1作為 DN大鼠成模標準。

1.2.3 分組與給藥 造模成功后大鼠隨機分為模型組、中藥組、對照組及假手術組各15只，共60只。各組自造模成功第1d起開始給藥。假手術組，模型組:給予每日1次1mL蒸餾水灌胃;中藥組:將腎白寧浸膏溶于生理鹽水，配制成混懸液，以2.97g·kg－1灌胃，每日1次;對照組:洛汀新(貝那普利)溶于生理鹽水，配制成混懸液，0.9mg·kg－1灌胃，每日1次。均給藥12w，每2w稱重調整劑量。給藥期間每組大鼠分籠飼養，隨意飲水，食用標準動物飼料。

1.2.4 觀察指標及檢測方法

采用原位末端標記法檢測細胞凋亡，Bax，Bcl－2檢測采用免疫組化的方法，并使用圖像采集系統測定陽性反應面積，每張切片隨機選取五個視野，每組分析15個標本。此項內容由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院病理科幫助完成。

1.3 統計學處理

2 結果

12w后光鏡下可見模型組腎小球毛細血管球萎縮，球囊腔略增大，腎小球出入球小動脈有輕度內皮細胞增生及纖維化，基底膜略增厚，遠曲小管擴張，腎間質充血，水腫，血細胞浸潤，并有輕度間質纖維化。模型組，中藥組，對照組細胞凋亡陽性表達較假手術組高，有顯著性差異(P<0.01);中藥組，對照組與模型組比較陽性表達低(P<0.01);中藥組與對照組無明顯差異(P>0.05)。腎小球中Bax，Bcl－2表達各組幾乎為陰性，腎小管中Bax，Bcl－2表達假手術組顯著低于其他三組(P<0.01);中藥組，對照組與模型組比較Bax陽性表達低(P<0.01)，而Bcl－2表達高(P<0.01);中藥組與對照組比較無明顯差異(P>0.05)，結果見表1。

表1 各組腎組織細胞凋亡及Bax，Bcl－2表達情況(±s)

表1 各組腎組織細胞凋亡及Bax，Bcl－2表達情況(±s)

注:與假手術組比較，*P<0.01，與模型組比較，△P<0.01。

組別 n 細胞凋亡Bax Bcl－2假手術組15 8.69±0.56 10.03±0.74 8.98±1.85模型組 15 42.48±0.61* 39.38±3.07* 23.03±0.85*中藥組 15 24.17±0.81*△ 26.42±0.71*△ 37.16±1.92*△對照組 15 25.52±0.64*△ 26.17±0.92*△ 35.95±0.97*△

3 討論

細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細胞吞噬［2］。

細胞凋亡是受基因調控的一種主動連續的程序化反應，Bcl－2蛋白的生理功能主要是抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，而不影響細胞周期和分化［3，4］。Bax是拮抗Bcl－2的促凋亡因子，它是Bcl－2結合蛋白，并與其有同源序列。Bcl－2的過剩有助于細胞存活，而Bax 的過剩有助于細胞死亡［3，4］。

Ortiz等［5］研究發現，高糖濃度促進了凋亡調節基因Bcl－2的表達下調及Bax基因表達的上調，促進近端小管上皮細胞凋亡。同時體內研究表明，在糖尿病db/db鼠腎皮質Bcl－2基因表達下降，Bax基因表達上調，與非糖尿病db/m鼠比較，前者變化與凋亡指數相關。

本實驗結果顯示，中藥組細胞凋亡數明顯少于模型組，與對照組無顯著性差異。腎白寧通過抑制Bax表達，上調Bcl－2表達而起到了抑制腎組織細胞凋亡的作用，保護了腎功能，延緩了DN的進展。

［1］ 馬艷春，周波，張立凈，等.中藥治療糖尿病腎病的作用機制研究進展［J］.中醫藥學報，2009，37(6):105 －108.

［2］ 溫進坤，韓梅.醫學分子生物學理論與研究技術［M］.第2版.北京:科學出版社，2002:244－261.

［3］ White E.Life，death，and the pursuit of apoptosis［J］.GenesDev，1996，10(1):1 －15.

［4］ 趙燕，楊秋萍.糖尿病腎病與細胞凋亡及其相關基因研究進展［J］.醫學綜述，2007，13(12):911 －913.

［5］ Ortriz A，Ziyadeh FN，Neilson EG.Expression of apoptosis－regulatory gene in renal proximal tubular epithelial cellsexposed to high ambient glucose and in diabetic kidneys［J］.Invest Med，1997，45(2):50 －56.