間歇運動對腎上腺髓質素特異性受體基因表達的影響

李宏偉

（贛南師范學院 體育學院，江西 贛州 341000）

間歇運動對腎上腺髓質素特異性受體基因表達的影響

李宏偉

（贛南師范學院 體育學院，江西 贛州 341000）

為了研究間歇運動(intermittent exercise)對腎上腺髓質素受體活性修飾蛋白 2 (Receptor activity modifying protein，RAMP2)和降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)(兩者組成ADM特異性受體)基因表達的影響，探討腎上腺髓質素(Adrenomedullin，ADM)在間歇運動誘導心肌細胞保護中的作用機制。將SD大鼠30只，分為對照組(C組)，間歇運動組(IE組)。IE組進行3周的間歇跑臺運動，應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測腎上腺髓質素特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達。結果得到IE組大鼠RAMP2 mRNA和CRLR mRNA表達明顯上調。說明間歇運動上調ADM特異性受體的基因表達，可使心肌組織中ADM特異性受體的含量增加，ADM對于心臟的作用會因特異性受體的伴隨性上調而加強，這對于增強心肌收縮力，擴張冠狀動脈，使心肌功能及冠狀動脈血流量得以保證，在運動中維持血液動力學穩定和保護心肌細胞起重要的作用。

運動生物化學；間歇運動；腎上腺髓質素；受體活性調節蛋白2；降鈣素受體樣受體；基因表達

間歇運動(intermittent exercise)的心肌細胞保護作用已被大多數的研究所認可[1-7]，其機制與間歇運動誘導內源性保護物質產生，提高抗氧化酶活性，開放線粒體ATP敏感的鉀通道(mKATP)，改善心功能，減少心肌酶的漏出，減小心肌梗塞面積和危險面積，降低心律失常發生率，減輕組織脂質過氧化反應有關。研究表明，運動預適應誘導產生的保護物質與間歇運動的心肌細胞保護關系最為密切，是研究的熱點。目前研究顯示，間歇運動誘導產生的保護物質主要與以下3類物質的改變有關：①抗氧化酶活性的提高；②應激蛋白的產生；③內源性保護物質的合成和釋放。內源性保護物質主要集中在心血管的活性物質。心血管活性物質是一組對心肌細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及相關細胞的功能調節具有重大影響的物質，除包括支配心肌、血管的神經釋放的神經遞質外，還包括一些小分子物質(NO、PG)；細胞因子和生長因子類以及心血管活性肽。心血管活性肽是該類物質中成員最多、功能最復雜的一些短肽，在間歇運動中起重要作用。主要包括：①腎素-血管緊張素系統；②內皮素系統；③降鈣素/降鈣素基因相關肽超家族；④激肽釋放酶-激肽系統和利尿鈉肽家族。其中大部分物質在心肌缺血預適應中起的作用已經被證實。這些物質在間歇運動誘導的預適應中是否也起到同樣的作用？盡管在降鈣素/降鈣素基因相關肽超家族中的降鈣素基因相關肽(配體)的作用已被孫曉娟，潘珊珊等[8]的研究證實，與其同一家族的腎上腺髓質素(配體)也被李宏偉，潘珊珊等[9-10]的研究證實，但配體與受體結合才能發揮配體的作用，才能全面闡明保護機制，因此本研究在復制間歇運動動物模型的基礎上，應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測腎上腺髓質素特異性受體-腎上腺髓質素受體活性修飾蛋白 2(receptor activity modifying protein，RAMP2)和降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)的基因表達，以全面闡明腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)在間歇運動誘導心肌細胞保護中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物及實驗模型的建立

采用雄性健康SD大鼠40只，隨機分為對照組(C組)，間歇運動組(IE組)。EP動物模型的運動方案參照文獻[1-5，7]制定，即IE組大鼠以速度30 m/min，坡度為0°，持續時間為60 min，共3周的運動負荷進行跑臺訓練。在60 min的間歇跑臺訓練中，大鼠運動15 min，休息5 min，重復3次。C組大鼠放在跑臺上

實驗數據采用SPSS12.0軟件處理，所有數據均用平均數±標準差(±s)表示，組間比較采用兩樣本均數t檢驗，以P<0.05為差異具有顯著性。同樣時間，但不運動。淘汰運動能力差的大鼠。

1.2 取材

建模結束后，各組大鼠均以質量分數為0.4%戊巴比妥鈉(100 g體重1 mL)腹腔麻醉后，取仰臥位固定，打開胸腔，暴露心臟，從心尖處插入灌注針頭，緩慢注入質量分數為1%肝素2 mL，再快速滴注質量分數為0.85%的生理鹽水400 mL，并迅速剪斷后腔靜脈。待生理鹽水滴完后，迅速取整心-80 ℃冰箱保存。

1.3 實時熒光定量RT-PCR實驗

取100 mg大鼠心臟，用電動勻漿器進行勻漿；兩相分離，RNA沉淀，RNA清洗，振蕩溶解，RNA沉淀。根據 GenBank進行引物設計：GAPGH(內參基因)CRLR、RAMP2的引物序列(表1)，制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板，針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。設置PCR反應：95 ℃變性3 min；40個PCR循環(94℃ 20 s；59℃ 20 s；72℃ 30 s)；72℃延伸5 min。PCR產物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物為單一特異性擴增條帶。將PCR產物進行10倍梯度稀釋：設定PCR產物濃度為1，分別稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7，1×10-8、1×10-9等梯度濃度的 DNA。這幾個梯度稀釋的 DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系。PCR反應溶液置于Light Cycler System熒光PCR儀(RG-3000，Roche Diagnostics，Switzerland)上進行反應。GAPDH：95℃ 5 min；35個PCR循環(95℃ 10 s；59℃ 15 s；72 ℃ 20 s；84 ℃(收集熒光)，5 s）；RAMP2：95 ℃ 5 min；40個 PCR 循環(95 ℃ 10 s；59 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s；85 ℃(收集熒光)，5 s)；CRLR：95 ℃ 5 min；40 個 PCR 循環(95 ℃ 10 s；59 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s；80 ℃(收集熒光)，5 s)。計算各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.4 統計學處理

2 結果及分析

各因子引物序列設計(表 1)、實時定量 PCR時各樣品加樣量均為1 μL，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的1 μL體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因 GAPDH(不同樣品間表達量基本恒定)作為內參，以樣品待測基因的值除以此樣品內參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量(表 2)。

表1 各因子引物序列設計

表2 各組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA表達的變化(±s)

表2 各組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA表達的變化(±s)

1)與對照組比較，P<0.01；2)與對照組比較，P<0.01

組別 n/只 受體 基因的相對含量對照組 15 RAMP2 1.96±0.21 CRLR 9.75±0.041)CRLR 5.48±0.25運動預適應組 15 PAMP2 5.84±0.312)

熒光定量RT-PCR擴增結果發現，達到額定熒光閾值的循環次數(Ct)介于20～30次。根據標準曲線，可以推測CRLR mRNA及RAMP2 mRNA的起始拷貝數均在102～106，處于線性范圍內。由表2可以看出，運動預適應組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA基礎表達量(以校正后的基因拷貝數的相對含量表示)顯著高于對照組(P<0.01)，提示運動預適應后，CRLR mRNA及RAMP2 mRNA基因表達水平上調。表明運動預適應提高了大鼠ADM特異性受體基因表達的調控能力。

3 討論

目前有多種受體可與ADM作用，主要有CGRP1受體和孤兒 G-蛋白偶聯受體(Orphan G protein coupling receptor，oGPCR)的RDC-1、L1及降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)等[11]。近年發現 ADM受體表型不僅取決于受體本身結構，還取決于一種受體活性修飾蛋白(Receptor activity modifying protein，RAMPs)的調控[12-13]，RAMPs有3個成員，即RAMP1、RAMP2、RAMP3，其中RAMP1與CRLR結合并轉運至細胞膜成為功能性降鈣素基因相關肽受體(CGRPR)，而RAMP2與CRLR結合則為特異性ADM受體(RAMP2/CRLR)，RAMP3功能還不清楚。可見，RAMP2與CRLR的同時變化才是ADM發揮作用的關鍵所在。

關于運動對ADM特異性受體基因mRNA表達的研究非常有限。袁銘等[14]應用Boster公司生產的ADM受體原位雜交試劑盒，探討 ADM受體的表達，結果顯示在培養的血管內皮細胞出現棕黃色顆粒，說明血管內皮細胞有ADM受體 mRNA的表達，但該實驗未區分 RAMP2和 CRLR，因此特異性不強。賀杰等[15]讓SD大鼠無負重游泳適應訓練1周后進行5周遞增負荷游泳訓練，5次/周，50 min/次，以后的每周游泳訓練遞增10 min，直至90 min/次，并保持此強度到訓練結束。結果提示，長時期進行低強度的有氧游泳訓練能在不同程度上引起心臟RAMP2 mRNA表達顯著上調，反映出長期低強度有氧運動在分子水平上的良好適應，而長時期進行低強度有氧游泳訓練對主動脈的影響是RAMP2 mRNA表達無顯著變化，但該實驗沒有同時測定CRLR，因此不能全面反映ADM特異性受體的調控機制。本實驗通過實時熒光定量 PCR對ADM的特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達同時進行了研究。結果顯示，間歇運動同時上調 ADM的特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達，說明間歇運動促使心肌細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞合成和釋放ADM作用于心肌局部，同時通過上調RAMP2和CRLR的基因表達，上調RAMP2和CRLR，然后作用于心肌細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞，通過信號轉導而發揮其調節心血管功能的作用及在運動中維持血液動力學穩定和保護心肌細胞免受損傷。

研究表明，心肌受到傷害性刺激后，如缺血、缺氧，機械壓性應力增強、心肌細胞的伸長，炎性因子如白細胞介素-1、腫瘤干擾因子、脂多糖、血管緊張素-Ⅱ、內皮素-1等分泌增加，ADM mRNA表達顯著增加。這些因素同樣也可以使心肌細胞上的 ADM受體發生質和量的變化稱為 ADM受體調節，受體調節可以使心肌更好地適應內外環境的變化，但如受體反應性減弱可保護細胞免受過量或長期刺激而導致生理功能紊亂，但受體過度則又會引起一系列病理性后果。大強度運動是一種傷害性刺激，可以顯著提高交感-腎上腺髓質系統活動，極大增加心率和血壓，造成血流動力學穩態失衡，心肌發生缺血缺氧，進而可能發生心肌頓抑，甚至心源性運動猝死。因此，機體為了抵御這種損傷調動了各種機制，間歇運動是其中重要的機制之一。間歇運動實施心臟保護主要是通過調動和激發內源性保護物質。本實驗結果提示，間歇運動的刺激能顯著啟動心臟CRLR和RAMP2的基因轉錄，或者說引起心臟 CRLR mRNA和RAMP2 mRNA量的積累，因而可對心肌組織中CRLR和RAMP2 含量會有顯著影響。經過間歇運動訓練后，心臟CRLR mRNA和RAMP2 mRNA表達上調可使心肌組織中CRLR和RAMP2含量增加。同時ADM對于心肌的作用可能會因為CRLR和RAMP2的伴隨性上調而加強。在EP中ADM增強心肌收縮力，擴張冠狀動脈，這樣使心肌功能及冠狀動脈血流量得到保證。ADM對心臟的作用必須通過和心臟相應的 ADM特異性受體結合并通過受體的調節來完成。本實驗 CRLR mRNA和 RAMP2 mRNA上行調節的結果提高了心臟局部的ADM 的水平，增強ADM對心臟的作用。間歇運動刺激的ADM受體正向調節作用是適度的反應性增強調節，能增強心臟對運動的適應，如運動的強度或方式的改變可能會導致調節過度或受體失敏。這從另一個側面反映了間歇運動對心肌細胞的保護作用是機體對間歇運動這種運動形式產生了良好的生物學適應。

間歇運動上調ADM特異性受體CRLR和RAMP2的基因表達，可使心肌組織中CRLR和RAMP2的含量增加，ADM對于心臟的作用會因CRLR和RAMP2的伴隨性上調而加強，這對于增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈，使心肌功能及冠狀動脈血流量得到保證，在運動中維持血液動力學穩定和保護心肌細胞起重要的作用。

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Effects of intermittent exercising on the gene expression of particular adrenal medullarin receptors

LI Hong-wei
（School of Physical Education，Gannan Normal University，Ganzhou 341000，China）

In order to study the effects of intermittent exercising on the gene expression of adrenal medullarin(ADM) receptor activity modifying protein 2 (RAMP2) and calcitonin receptor like receptors (CRLR), which constitute particular ADM receptors, and to explore the functioning mechanism of ADM in intermittent exercising inducing cardiac muscle cell protection, the authors divided 30 SD rates into a control group (group C) and an intermittent exercising group (group IE), let the rats in group IE do a 3-week intermittent treadmill exercise, applied real time fluorescent quantified reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to test the expression of particular ADM receptors RAMP2 and CRLR, and revealed that the levels of expression of RAMP2 mRNA and CRLR mRNA of the rats in group IE increased significantly, which indicates that intermittent exercising increases the gene expression of particular ADM receptors, can increase the contents of particular ADM receptors in cardiac muscle tissues, and that the functions of ADM on the heart are enhanced by the increase of particular receptors, which plays an important role in strengthening cardiac muscle contraction, dilating coronary arteries, ensuring cardiac muscle functions and coronary artery blood flow, as well as maintaining hemodynamic stability and protecting cardiac muscle cells during exercising.

sports biochemistry；intermittent exercise；adrenal medullarin；receptor activity modifying protein 2；calcitonin receptor like receptor；gene expression

G804.7

A

1006-7116(2010)10-0105-04

2010-03-29

李宏偉（1969-），男，副教授，博士，研究方向：運動醫學。