高效液相色譜法測定復方替硝唑洗劑中主藥的含量

王琤帥，吳韶銘

（浙江省金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000）

復方替硝唑洗劑是浙江省金華市第五醫院自制婦科炎癥外用制劑，由替硝唑、醋酸氯己定、冰片和其他輔料組方，收載于2005年版《浙江省醫療機構制劑規范》，分別采用分光光度法和雙波長吸收法測定含量。筆者參閱相關文獻[1－3]，建立了能同時測定該制劑中替硝唑和醋酸氯己定含量的高效液相色譜（HPLC）法。報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜系統(包括四元梯度泵、紫外檢測器、Agilent 1100 LC化學工作站)，Mettler AE240S型電子天平。替硝唑對照品（批號為100336－200402），醋酸氯己定對照品（批號為100183－199902)，均由中國藥品生物制品檢定所提供；復方替硝唑洗劑（規格為 250 mL，批號為 071225，080512，080617，金華市第五醫院制劑室，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津 VP－ODS柱(150 mm ×4.6 mm，5!m)；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀4 g、三乙胺2.5 mL、庚烷基磺酸鈉1 g，加水至 1 000 mL，用磷酸調 pH 至 2.5)－甲醇(40∶60）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20!L。

2.2 溶液制備

分別精密稱取替硝唑對照品75.2 mg和醋酸氯己定對照品13.1 mg，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（每1 mL中分別含替硝唑和醋酸氯己定0.752 mg和0.131 mg）。精密吸取樣品5 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣前用0.45!m濾膜過濾，即得供試品溶液。按處方組成，取除替硝唑和醋酸氯己定以外的群藥，制成空白制劑，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗：在該色譜條件下，吸取替硝唑對照品溶液、醋酸氯己定對照品溶液適量，分別進樣，以確定兩成分的保留時間；再分別吸取2.2項下3種溶液，注入液相色譜儀。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相同保留時間的峰，而陰性對照品溶液在此保留時間無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，以峰面積 A為縱坐標、質量濃度 C（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程替硝唑 A=8 454.694 0 C+24.594 6，r=0.999 8(n=6)；醋酸氯己定 A=55 998.512 6 C+16.221 1，r=0.999 9(n=6)。結果表明，替硝唑和醋酸氯己定的質量濃度分別在 37.6～376!g/mL和 6.55～65.5!g/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗：精密吸取同一質量濃度的混合對照品溶液，重復進樣，結果替硝唑及醋酸氯己定的峰面積平均值分別為1 291和1 465，RSD 分別為 0.31%和 0.57%(n=6)。

重現性試驗：取同一批樣品，依法制備供試品溶液，分別進樣。結果替硝唑及醋酸氯己定平均含量分別為3.018 1 mg/mL和0.506 0 mg/mL，RSD 分別為 0.43%和 0.49%(n=6)，表明方法重現性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 時依法測定，結果替硝唑與醋酸氯己定峰面積的 RSD分別為0.45%和0.54%(n=5)，表明該溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密吸取樣品5 mL，置100 mL量瓶中，共6份，分別精密加入混合對照品溶液4，5，6 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定含量。結果見表1。

表1 替硝唑和醋酸氯己定加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取不同批號的供試品3批，按照供試品溶液制備方法處理并測定。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

最大吸收波長替硝唑在310 nm附近，醋酸氯己定在259 nm附近，考慮到處方中替硝唑的量是醋酸氯己定的6倍，而替硝唑在259 nm波長處的吸收也較強，故測定波長選擇260 nm，以使兩成分的峰面積相近。

流動相及其pH對試驗結果影響較大。筆者曾用乙腈－水（35∶65）、甲醇 －水（60∶40）等不同比例的流動相，結果出峰時間太快且峰形不好。而選用甲醇－水－三乙胺（60∶40∶0.7）或者乙腈－甲醇－水－三乙胺（20∶50∶30∶0.7）同樣存在出峰時間過快，且醋酸氯己定峰的對稱性不佳。最后選擇加離子對試劑庚烷基磺酸鈉，同時調節pH，庚烷基磺酸鈉與醋酸氯己定形成離子對，改善了峰形。同時測試了加辛烷基磺酸鈉作為離子對試劑，結果沒有明顯的差異。故最終選擇文中的色譜條件，可使醋酸氯己定出峰穩定，且峰面積及保留時間適中。

[1]黃寶立，張 華.HPLC法測定口含片中替硝唑與氯己定的含量[J].西北藥學雜志，2000，15（2）：51.

[2]錢 方，黃 偉，王雯潔，等.高效液相色譜法測定復方替硝唑漱口液中主藥的含量[J].中國藥房，2003，14（5）：298.

[3]鄭 芳，朱雪松，何 婧.反相高效液相色譜法測定復方替硝唑栓三組分含量[J].醫藥導報，2007，26（11）：1 367.