液相色譜法快速測定乳制品中三聚氰胺含量

郭立泉，辛若竹，丁梅，閆吉昌

（1.吉林工商學(xué)院生物工程分院，吉林長春130062；2.梅河口市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林梅河口135000；3.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

液相色譜法快速測定乳制品中三聚氰胺含量

郭立泉1，辛若竹2，丁梅2，閆吉昌3，*

（1.吉林工商學(xué)院生物工程分院，吉林長春130062；2.梅河口市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林梅河口135000；3.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

建立高效液相色譜法快速測定乳制品中三聚氰胺的分析方法。采用三氯乙酸溶液-乙腈提取乳制品中的三聚氰胺，用強(qiáng)陽離子交換色譜柱（SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm），在流動相配比為0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH＝3.0）-乙腈（65+35，體積比）條件下分離，紫外檢測器210mm波長檢測。結(jié)果表明：采用外標(biāo)法定量，該方法在0.10mg/L～10.0 mg/L濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率均在91%以上，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.2%，方法最低檢出限為0.01 mg/L。通過實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證證明，該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，樣品前處理簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，可滿足實(shí)驗(yàn)室日常快速檢測乳制品中三聚氰胺的工作需求。

液相色譜法；強(qiáng)陽離子色譜柱；紫外檢測器；乳制品；三聚氰胺

Abstract:An analysis method for quick determination of melamine from dairy products by HPLC has beendeveloped.Trichloroacetic acid-acetonitrile was used to extract melamine from dairy products,and HPLC analyses were performed using the following operating parameters：strong cation exchange column（SCX,250 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase ratio：0.05 mol/L KH2PO4（pH=3.0）/acetonitrile （65+35,volume ratio）,UV detector wavelength 210 nm.This method with good linearity relation between 0.10 mg/L-10.0 mg/L adopted external standard method.The recovery was above 91%and the coefficient of correlation R2was 0.9999.The relative standard deviation（RSD）was less than 1.2%.The limit of detection was 0.01 mg/L.This method is quick,precise and sensitive,it also has good advantage of simple pretreatment,which satisfies the needs of routine testing melamine of dairy products.

Key words：liquid chromatography；strong cation exchange column；UV detector；dairy products；melamine

國家衛(wèi)生部已將三聚氰胺列為非食用物質(zhì)禁止添加到乳制品及含乳食品中，新頒布的乳品安全國家標(biāo)準(zhǔn)更以食品安全風(fēng)險監(jiān)測和評估數(shù)據(jù)為依據(jù)，突出安全性要求，突出與人體健康密切相關(guān)的限量規(guī)定，進(jìn)一步明確了對三聚氰胺“零容忍”的規(guī)定，因此三聚氰胺的檢測已成為日常判定乳品是否安全的必檢項(xiàng)目之一。目前三聚氰胺在食品中殘留量的分析方法有很多報道，但多采用液相色譜法（HPLC）C18或C8色譜柱分離[1-5]，需要使用固相萃取小柱凈化樣品，操作步驟繁瑣，分析時間長，且回收率偏低；一些采用強(qiáng)陽離子色譜柱快速分離的方法[6-7]，也只適用于相對基質(zhì)干擾小的原料乳的測定，所以日常工作中很需要建立奶粉等乳制品中三聚氰胺的快速測定方法。本文參照GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》、GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測》檢測方法，對色譜條件及樣品處理進(jìn)行了探討和研究，采用強(qiáng)陽離子色譜柱（SCX），以磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈為流動相進(jìn)行分離，可在線有效去除奶粉等乳制品中雜質(zhì)干擾，提高檢測效率，獲得滿意的結(jié)果。并通過實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證證明，該方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可滿足實(shí)驗(yàn)室日常快速檢測乳制品中三聚氰胺的工作需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC20AT島津高效液相色譜儀（配SPD20A UV-檢測器、LCsolution工作站）；強(qiáng)陽離子交換色譜柱（CNWSIL SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm）；WP-UP-UV-05超純水機(jī)：四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；H1650高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QB-600高速振蕩混合器：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；AL204-1電子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；PHS-2C酸度計：上海雷磁儀器；FB-20T溶劑過濾器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.1.2 試劑

色譜純乙腈（Fisher Scientific）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%，Chemserwice）；優(yōu)級純磷酸二氫鉀、優(yōu)級純磷酸、分析純?nèi)纫宜幔簢幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有效公司；一次性注射器（2 mL）；水相/有機(jī)相濾膜（0.45 μm）；25 mL具塞刻度試管。

1.2 色譜條件

強(qiáng)陽離子交換色譜柱（SCX，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸二氫鉀緩沖液（0.05 moL/L，pH=3.0）∶乙腈=65∶35（體積比）；檢測波長 210 nm；流速1.5 mL/min；柱溫 30℃；進(jìn)樣量 20 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及磷酸緩沖液的配制

1.3.1 儲備液

準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用水完全溶解后，100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱中冷藏保存，有效期1個月。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確吸取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于10 μg三聚氰胺。于4℃冰箱中冷藏保存。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 （10 μg/mL）0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于 8個 10 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成 0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.4 0.05 moL/L磷酸鹽緩沖液

稱取6.8 g磷酸二氫鉀（準(zhǔn)確至0.01 g），加水800 mL完全溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，用水稀釋至1 L，用濾膜過濾后備用。

1.4 樣品處理

稱取奶粉等乳制品2.5 g（精確至0.01 g）于25 mL具塞刻度試管中，加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，超聲提取10 min，再于振蕩混合器上振蕩提取10 min后，用水定容至刻度，混勻。以10000 r/min高速離心15 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾，濾液過有機(jī)濾膜后，供HPLC測定。

1.5 校準(zhǔn)曲線的繪制與樣品測定

取1.3.3配制的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液系列經(jīng)0.45 μm水系膜過濾后，按從低到高濃度順序分別進(jìn)樣20 μL，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。同時取制備好的待測樣液樣20 μL分別進(jìn)樣，獲得目標(biāo)峰面積。根據(jù)校準(zhǔn)曲線計算被測試樣中三聚氰胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

三氯乙酸溶液和乙腈都可沉淀蛋白質(zhì)提取三聚氰胺。由于奶粉等乳制品中成分復(fù)雜，按文獻(xiàn)[6-7]直接用乙腈提取，沉淀蛋白質(zhì)的效果不理想，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重且容易出現(xiàn)壞柱等問題，見圖1。

本文選擇用三氯乙酸溶液-乙腈混合液作為乳制品中的蛋白質(zhì)的沉淀劑和三聚氰胺提取劑。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著取樣量的不同，即隨著樣品中蛋白質(zhì)和雜質(zhì)含量的增多，適當(dāng)增加三氯乙酸溶液-乙腈混合液的使用量，能完全沉淀蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，離心后獲得較好的上清液。經(jīng)多次試驗(yàn)證明，取樣2.5 g，加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，經(jīng)超聲、振蕩各提取10 min后，以10000 r/min高速離心，能有效地去除基質(zhì)干擾，且回收率較高。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，在普通C18或C8柱上保留值很低，接近死時間流出，不能進(jìn)行分析，必須使用離子對試劑，同時還需要使用固相萃取小柱凈化樣品，不僅操作繁瑣，分析時間長，造成回收率偏低，而且去除干擾峰的效果并不理想見圖2。

本文采用強(qiáng)陽離子交換色譜柱，可在線去除雜質(zhì)干擾，凈化樣品，免去使用固相萃取小柱要經(jīng)上樣、洗脫、氮吹等繁瑣步驟，不僅可有效節(jié)約時間，提高檢測效率，而且節(jié)約檢測成本。

2.2.2 檢測波長的確定

將配制好的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液（2 μg/mL）在190 nm～300 nm波長處進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺在210 nm和240 nm處均有特征吸收，但以210 nm處響應(yīng)值高，是240 nm處響應(yīng)值的4.3倍，且雜質(zhì)峰少，基線穩(wěn)定，因此選擇210 nm作為檢測波長，可有效地降低方法的檢出限，提高檢測靈敏度。

2.2.3 流動相的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[6-7]選取磷酸鹽（pH=3.0）-乙腈緩沖液作為流動相。由于樣品基質(zhì)中緊靠三聚氰胺出峰位之后總有個干擾峰出現(xiàn)，而且這2個峰的出峰時間很近，很難完全分離。如果流動相中磷酸鹽和乙腈的比例選擇不當(dāng)，很容易使目標(biāo)峰與干擾峰重合或峰分離效果不好，造成假陽性或檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確而誤判。本試驗(yàn)研究比較了流動相中磷酸鹽緩沖液的不同體積分?jǐn)?shù)對目標(biāo)峰與干擾峰分離效果的影響，結(jié)果見表1。

表1 磷酸鹽體積分?jǐn)?shù)對分離效果的影響Table 1 Effect of phosphate volume fraction on separation efficiency

由表1可知：磷酸鹽緩沖液體積分?jǐn)?shù)為65%時，目標(biāo)峰與干擾峰分離效果最好，且峰型對稱，出峰時間比較理想。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品及樣品加標(biāo)色譜圖

在本文優(yōu)化的色譜條件下，得到了三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、奶粉空白樣品和奶粉加標(biāo)樣品的色譜圖（見圖3～圖 5）。

從三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖（圖3）可知三聚氰胺出峰時間為11.554 min；從空白樣品色譜圖（圖4）和加標(biāo)樣品色譜圖（圖5）可以確定，三聚氰胺峰和基質(zhì)干擾峰得到很好的分離，可滿足檢測工作需要。

2.3 線性范圍、線性方程與檢出限

在選定的色譜條件下，按“1.5”項(xiàng)繪制三聚氰胺校準(zhǔn)曲線（各種濃度取3次進(jìn)樣平均值），得回歸方程為y=3.18×10-6x+8.57×10-3和相關(guān)系數(shù) R2=0.9999。表明：三聚氰胺在 0.1 μg/mL～10 μg/mL 的范圍內(nèi)，其濃度和峰面積有良好的線性關(guān)系。另外將低濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋，進(jìn)樣。當(dāng)S/N=3時，方法最低檢出限為0.01 mg/L；當(dāng)S/N=10時，方法定量檢出限為0.04 mg/L，說明該方法具有很高的檢測靈敏度，是國標(biāo)GB/T 22400-2008檢測法靈敏度的5倍。

2.4 方法的精密度和回收率

在未添加三聚氰胺的空白液態(tài)奶和奶粉中分別添加1.0、3.0、5.0 mg/kg 3個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，每個添加水平進(jìn)行5次平行測定，按本方法進(jìn)行提取凈化和測定，計算平均加標(biāo)回收率均在91%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.2%，具體數(shù)據(jù)見表2，說明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

表2 精密度及回收率測定結(jié)果(n=5)Table 2 Results of precision and recovery(n=5)

2.5 樣品測定及結(jié)果評價

市場上隨機(jī)選取奶粉、純牛奶、奶飲料3種樣品；能力驗(yàn)證考核試樣為A、B、C 3種奶粉樣品，共6種樣品。分別用本文方法對其三聚氰胺含量進(jìn)行測定見表3。

表3 樣品檢測結(jié)果及評價Table 3 Determination results and evaluation

評價結(jié)果表明：本文方法測定的結(jié)果均以|Z|值＜1的理想值接近于真值，說明該方法的準(zhǔn)確度極高。

3 結(jié)論

該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，樣品前處理簡便易行等優(yōu)點(diǎn)。不僅可有效節(jié)約時間，提高檢測效率，而且可降低檢測成本，易于推廣普及。適于奶粉等乳制品中三聚氰胺的批量、快速的檢測分析。

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008：2-4

[2]中國人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T1372-2007飼料中三聚氰胺的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007：1-3

[3]汪輝,彭新凱,李文麗,等.高效液相色譜測定生鮮乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究[J].食品科學(xué),2008,29(10)：531-535

[4]徐曉楓,蒲云霞,包玉龍,等.高效液相色譜法測定乳清粉中的三聚氰胺[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(3)：541-542

[5]侯冬巖,劉曉媛,刁全平,等.酸奶飲料中三聚氰胺的高效液相色譜法分析[J].鞍山師范學(xué)院學(xué)報,2008,10(6)：27-29

[6]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008：1-4

[7]肖洋,栗周偉,馮永渝,等.原料乳中三聚氰胺的高效液相色譜法測定[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(1)：45-46

Studies on Quick Determination of Melamine of Dairy Products by HPLC

GUO Li-quan1,XIN Ruo-zhu2,DING Mei2,YAN Ji-chang3,*
（1.Department of Bioengineering，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062,Jilin,China；2.Meihekou Quality Supervision and Inspection Station of Product，Meihekou 135000,Jilin,China；3.Department of Chemistry of Northeast Normal University，Changchun 130024,Jilin,China）

2010-06-29

郭立泉（1971—），女（漢），副教授，博士，主要從事生物工程研究。

*通信作者：閆吉昌（1943—），男，博士生導(dǎo)師。