自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定肉和肉制品中的三聚氰胺殘留

賈紅衛(wèi)，趙玉

（青海出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海西寧810000）

自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定肉和肉制品中的三聚氰胺殘留

賈紅衛(wèi)，趙玉*

（青海出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海西寧810000）

用Venusil ASB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為庚烷基磺酸鈉∶乙腈（pH3.2）=90∶10（體積比），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm的色譜條件下，經(jīng)提取處理并經(jīng)混合型陽(yáng)離子交換柱固相萃取凈化，對(duì)肉及肉制品中的三聚氰胺殘留進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明在0.5 μg～100.0 μg之間有較好的線性關(guān)系，r=0.9996。回收率在87%～94%，RSD 為 3.8%～4.2%（n=6）。

自動(dòng)固相萃取；高效液相色譜-紫外檢測(cè)；三聚氰胺殘留；肉和肉制品

Abstract:By high performance liquid chromatography-variable wavelength detector（HPLC-VWD）,the determination of melamine residue in meat and meat products was reported in this paper.Acetonitrile：water solution （50∶50）was used to precipitate proteins and to dissociate the target anlyte from the samples matrix.After an appropriate ultrasonic and centrifugal pretreatment,the supernatant was cleaned up with strong cation exchange column and separated on a C18column（4.6×250 mm，5 μm）with 0.01 mol/L sodium 1-heptanesulfate：acetonitrile （90∶10,Volume ratio）as mobile phase,at a flow rate of 1.0 mL/min and detected at 240 nm.The limit detection was 1.0 mg/kg,the average recovery was 87%-94.2%,and the response value was linear between 1.0 μg-100.0 μg,r was 0.9996.With an average RSD of 3.8%-4.2%（n=6）is obtained.

Key words：Solid phase extraction；HPLC-VWD；melamine residue；meat and meat products

三聚氰胺（melamine）又稱三氨三嗪，簡(jiǎn)稱三胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，白色無(wú)味結(jié)晶粉末。這種化學(xué)品常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑，在部分亞洲國(guó)家，它也被用于制造化肥，但嚴(yán)禁加入食品和飼料中。自2008年9月奶粉事件后，最近，又在雞蛋中檢出了三聚氰胺，從而引發(fā)由于食用飼料使動(dòng)物及其內(nèi)臟也含有三聚氰胺的擔(dān)憂。目前關(guān)于三聚氰胺殘留測(cè)定方法有GC-MS法、GC，LC-UV法、LC-MS等[1-2]，但在實(shí)際工作中，檢測(cè)對(duì)象均為乳制品、飼料等[3-4]。關(guān)于動(dòng)物肉制品和內(nèi)臟中三聚氰胺的檢測(cè)方法鮮見報(bào)道。本文建立了自動(dòng)固相萃取，HPLC-UV檢測(cè)動(dòng)物肉及肉制品中三聚氰胺的方法，用乙腈和水提取，含離子對(duì)緩沖液在高親水性C18柱進(jìn)行分析。大量樣品分析結(jié)果表明，該方法快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，可作為進(jìn)出口動(dòng)物肉和肉制品中三聚氰胺的一種快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HP1100高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器：美國(guó)Agilent公司；自動(dòng)固相萃取儀：法國(guó)Gilson公司；純水器：美國(guó)密理伯公司；組織搗碎機(jī)；混合型陽(yáng)離子交換柱（PCX，60 mg/3 mL）：美國(guó)Agela公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)買自Acros organics公司（純度≥99%）。甲醇、乙腈色譜純：Fisher公司；三氯乙酸、庚烷磺酸鈉、檸檬酸、氨水（含量約28%）：均為分析純；超純水。樣品來(lái)源：青海肉食品出口企業(yè)送檢樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱 Venusil ASB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agela公司）；流動(dòng)相：0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉(檸檬酸溶液調(diào)節(jié) pH 至 4.5)+乙腈(體積比為 90∶10)，等度洗脫，流速為 1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 240 nm；進(jìn)樣體積為 20 μL。

1.3 樣品制備

1.3.1 樣品提取

取肉樣，去可見脂肪組織，稱取（5.00±0.05）g樣品于 50 mL 離心管中，加 25 mL 乙腈-水（50∶50），組織搗碎機(jī)高速勻漿1 min，超聲提取20 min，3500 r/min離心10 min，使組織充分沉淀。精密取5 mL上清液至50 mL離心管中，加入0.01 mol/l HCl 5 mL并搖勻,加入正己烷10 mL，振蕩2 min，3500 r/min離心10 min，使其分層。將上層水溶液移至另一個(gè)帶蓋的離心管中，用水充分洗滌正己烷層以充分去除脂肪，合并水溶液并離心3500 r/min，10 min，上清液為待凈化液。

1.3.2 樣品凈化（固相萃取參數(shù)）

活化：甲醇、水各3 mL，上樣：待凈化液8 mL，淋洗：甲醇、水各 3 mL 空氣抽干，洗脫：2 mL×3次，5%氨水甲醇溶液過(guò)柱，濃縮，氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相定容至1 mL，渦旋混勻，0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，HPLC-UV測(cè)定。

1.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品用20%甲醇配制成1.0 g/L的儲(chǔ)備液，避光冷藏保存。

臨用時(shí)用流動(dòng)相溶液稀釋到相應(yīng)的濃度，制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇和提取條件的優(yōu)化

三聚氰胺屬于強(qiáng)極性堿性化合物，因此提取溶劑一般都選用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑、緩沖溶液或有機(jī)溶劑和水的混合溶液。本試驗(yàn)中分別考察了甲醇、乙腈、乙腈水溶液、1%三氯乙酸溶液、1%乙酸鉛溶液沉淀蛋白并提取三聚氰胺的效果。在空白肉樣中添加20 mg/kg水平的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用HPLC-UV測(cè)定其回收率，以比較不同提取劑的提取效果，結(jié)果見表1。

從表1的結(jié)果可以看出純有機(jī)溶劑的提取回收率低，其余溶劑的提取效率在75%~95%之間，乙腈水溶液和1%三氯乙酸水溶液提取率高而且都能夠有效的沉淀蛋白質(zhì)，但考慮到三氯乙酸、乙酸鉛的使用會(huì)影響色譜柱的使用壽命，甚至?xí)斐缮V系統(tǒng)的堵塞，對(duì)色譜分析中的峰形也產(chǎn)生影響，而乙腈水溶液沉淀蛋白的效果良好，三聚氰胺的回收率在90%以上，提取液與流動(dòng)相的組成基本相同，有利于保護(hù)色譜系統(tǒng)，故本文最終選擇選用乙腈水溶液作為提取溶劑。

脂肪組織的極性很小，三聚氰胺的極性很大，所以脂肪里面基本不會(huì)含有三聚氰胺，用正己烷提除脂肪殘留，以避免對(duì)色譜分析造成影響。

由于三聚氰胺溶解性較弱，提取時(shí)間對(duì)回收率也有較大影響，摸索并最終確定超聲提取20 min效果最佳。

三聚氰胺呈弱堿性，凈化過(guò)程一般選擇陽(yáng)離子交換柱，選用的混合型陽(yáng)離子交換柱（PCX）由于具有陽(yáng)離子和反相2種吸附機(jī)理，使樣品凈化更徹底，提高了檢測(cè)靈敏度，批次重復(fù)性好，回收率也較高。在樣品液中加0.01 mol/L HCl鹽酸可以增加C18柱對(duì)三聚氰胺的保留和改善峰形。

表1 不同提取溶劑對(duì)肉制品中三聚氰胺提取效果的比較（n=6）Table 1 Extraction eficiency of melamine in samples by diferent solvents(n=6)%

2.2 色譜條件的優(yōu)化

三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留差，需要用離子對(duì)試劑色譜方法才能有良好的保留和分離，參考文獻(xiàn)[7]方法，在流動(dòng)相中加入庚烷磺酸鈉使三聚氰胺產(chǎn)生很好的保留。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法中三聚氰胺的保留時(shí)間在7.2 min左右，沒有干擾峰，見色譜圖1。

2.3 線形分析、檢出限

用流動(dòng)相配制的相應(yīng)濃度三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，本方法在濃度為0.5 mg/kg時(shí)相關(guān)系數(shù)為0.9996，回歸方程線為 Area=76.6Amt-2.8，說(shuō)明在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

在空白肉樣中添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC—UV方法的檢測(cè)低限為0.5 mg/kg[按信噪比（s/N）大于3計(jì)算]。

2.4 回收率和精密度試驗(yàn)

取經(jīng)檢驗(yàn)不含三聚氰胺的樣品，分別按樣品中0.5、10.0、50.0 mg/kg含量水平添加一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一添加濃度重復(fù)6份樣品，按上述方法測(cè)定，計(jì)算其回收率和精密度，結(jié)果見表2。

表2 肉空白樣品中添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品后的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Recovery and precision of melamine spiked in blank meat（n=6）

2.5 樣品的檢測(cè)

對(duì)本地出口的肉類進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出三聚氰胺，非常適合實(shí)際應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究建立了對(duì)肉和肉制品中的三聚氰胺殘留量的檢測(cè)方法。并通過(guò)試驗(yàn)，確定了自動(dòng)固相萃取的最佳淋洗液、洗脫液比例以及洗脫液用量，優(yōu)化了提取和測(cè)定的條件，三聚氰胺的檢出限為0.5 μg/mL，0.5 μg～100.0 μg 之間回收率為 87%～94% ，RSD 為3.8%～4.2%，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9996。符合殘留分析方法的相關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)結(jié)果表明方法本文建立的具有特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，對(duì)本地出口的肉類進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出三聚氰胺，非常適合實(shí)際應(yīng)用。

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Determination of Melamine Residue in Meat and Meat Products by Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography Solid

JIA Hong-wei，ZHAO Yu*
（Qinghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau,Xining 810000,Qinghai,China）

2010-05-08

賈紅衛(wèi)（1967—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士，從事食品安全研究。

*通信作者