TGF-beta1誘導人肺腺癌PC9細胞上皮-間質轉化的研究

張慧君 張雷 王和勇 陳曉峰

在惡性腫瘤中，肺癌仍是目前最常見的死亡原因。許多肺癌患者在就診時已發生轉移，據統計90%的肺癌患者死亡由轉移引起[1]，最近研究[2,3]表明上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在腫瘤侵襲轉移過程中起重要作用。

EMT是指上皮細胞失去其上皮特征，獲得間質特性的過程，它不僅參與胚胎形態的形成、心臟的發育和慢性退行性纖維化，而且促進腫瘤侵襲轉移[4]。此外，細胞外信號的生長因子如HGF、EGF、TGF-β、IGF、VEGF等可經過不同的信號通道誘導細胞發生EMT，已證實PI3K/AKT信號通路參與EMT發生[5]。本文旨在研究TGF-β1誘導人肺腺癌PC9細胞發生EMT及對PI3K/AKT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌PC9細胞為上海肺科醫院肺癌免疫研究室常規傳代培養；TGF-β1購自R&D公司；單克隆兔抗人E-cadherin、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT均購自Cell Signaling Technology公司；單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin購自Santa Cruz公司；辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG購自Abgent公司；F1TC標志的羊抗兔IgG購自Upstates公司；DMEM購自Gibco公司。

1.2 細胞培養 PC9細胞在37oC、5%CO2、飽和濕度條件下用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、低糖-DMEM培養基中培養。用0.25%胰酶消化傳代。細胞培養至融合70%-80%后，用無血清培養基饑餓過夜，再加入TGF-β1處理48 h，按實驗要求分組。

1.3 細胞形態學觀察 將PC9細胞傳代于6孔板并用無血清培養基饑餓過夜，經不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后在相差顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。

1.4 Western blot檢測 不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理細胞48 h后，培養瓶中的貼壁細胞用4oC的PBS洗滌后轉移到EP管，12 000 rpm離心5 min，棄去上清，將收集到的細胞加入細胞裂解液裂解后，取上清液-20oC儲存。上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V電壓使蛋白分離并轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。用單克隆兔抗人的E-cadherin（1:1 000）、單克隆小鼠抗人的Fibronectin和Vimentin（1:100）、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT（1:500）分別與膜接觸4oC孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜5 min×3次，在加辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3次，加入ECL化學發光顯示劑在室溫下反應1 min后，用X光片曝光，然后定影、顯影。

1.5 細胞免疫熒光檢測 以每孔1×104個細胞接種于6孔培養板中預置的載玻片上，細胞貼壁爬片，用無血清培養基饑餓過夜，加入不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，取出載玻片，用0.4%多聚甲醛固定15 min，加入單克隆兔抗人的E-cadherin（1:200）、單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin（1:50）4oC過夜，加FITC標志的羊抗兔IgG和Cy3標志的羊抗小鼠IgG（1:50），37oC下孵育1 h，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2 結果

2.1 TGF-β1誘導PC9細胞形態學變化觀察 PC9細胞在不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，通過相差顯微鏡觀察，未處理的PC9細胞呈不典型上皮細胞形態，經TGF-β1刺激后，大部分細胞形態明顯拉長，呈現明顯的間質細胞形態，且5 ng/mL TGF-β1組比1 ng/mL組更為明顯。此外，細胞間連接也變得更疏松（圖1）。

2.2 TGF-β1對PC9細胞上皮及間質標記蛋白表達的影響不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理PC9 細胞48 h后，Western blot顯示TGF-β1并不影響PC9細胞上皮標記蛋白E-cadherin和間質標記蛋白Vimentin的表達。然而，間質標記蛋白Fibronectin的表達量卻隨TGF-β1濃度的增加也相應增加（圖2）。另外通過細胞免疫熒光也證實了Western blot的結果（圖3）。

2.3 TGF-β1對PI3K/AKT信號通路的影響 PC9細胞經不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，Western blot顯示P-AKT經TGF-β1處理后其表達量降低，且1 ng/mL組和5 ng/mL組P-AKT表達量減少大致相仿（圖4）。

3 討論

腫瘤轉移是惡性腫瘤進展的重要步驟，也是惡性腫瘤患者死亡的重要原因。因此研究腫瘤轉移的分子機制對抑制惡性腫瘤轉移、提高腫瘤患者生存率至關重要。腫瘤轉移是一個復雜的、多步驟的過程，首先腫瘤細胞脫離原發灶，通過血管生成和基底膜重建進入循環系統，但進入循環系統的腫瘤細胞必須克服循環系統的各種障礙才能到達轉移部位。腫瘤轉移涉及多種調控機制，其中促進腫瘤細胞轉移的重要機制之一就是EMT[6,7]。

Greenburg等[8]指出培養中的上皮細胞可獲得間質細胞特性，最早提出了EMT發生的證據。在胚胎形成、腫瘤發生發展及某些纖維化疾病的過程中，TGF-β作為EMT的主要誘導劑備受關注[9]。TGF-β1作為TGF-β家族的重要成員之一，在腫瘤發生發展及某些纖維化疾病過程中已被證實為EMT的主要誘導劑[10-13]。但是，對人肺腺癌PC9細胞來說，TGF-β1能否誘導PC9細胞發生EMT及對PI3K/AKT信號通路影響又如何？目前尚無相關報道。

圖 1 PC9細胞經不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后的形態學變化Fig 1 Morphologic changes of PC9 cells induced by different concentrations (0 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL) of TGF-β1 for 48 h

圖 2 Western blot檢測PC9細胞EMT相關標記蛋白Fibronectin表達變化Fig 2 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was assessed by Western blot

圖 3 細胞免疫熒光檢測PC9細胞EMT相關標記蛋白Fibronectin表達變化Fig 3 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was detected by immunoflurescence staining

圖 4 Western blot檢測TGF-β1對PC9細胞AKT和P-AKT的表達Fig 4 The expression of AKT and P-AKT in PC9 cells was assessed by Western blot

TGF-β1誘導PC9細胞發生EMT首先在細胞形態方面被證實[7]。Kasai等[11]指出肺腺癌A549細胞在TGF-β1作用下，由典型卵石狀的上皮表型轉化成纖維細胞樣的間質表型，同時相鄰細胞間連接也變得疏松[11]。Yan等[14]用低氧處理肝癌細胞發生EMT，細胞誘導形態結果與Kasai 相似。本研究結果顯示未處理的PC9細胞呈不典型的上皮細胞形態，經TGF-β1處理后大部分細胞形態較未處理組明顯拉長，相鄰細胞間連接也變得疏松。為了進一步證實經TGF-β1處理的PC9細胞可發生EMT，我們首先用Western blot驗證EMT相關標記蛋白，結果顯示TGF-β1處理PC9細胞既沒有下調上皮標記蛋白E-cadherin的表達，也沒上調間質標記蛋白Vimentin的表達，僅僅是上調了間質標記蛋白Fibronectin的表達，細胞免疫熒光也證實了間質標記蛋白Fibronectin表達上調。Shintani等[15]指出培養中的腫瘤細胞僅發生不完全EMT，從嚴格意義上講我們并不能觀察到真正的EMT[15]。Voulgari等[16]指出發生不完全EMT的腫瘤細胞，其分子標記物和細胞特征可發生不同程度的改變[16]。因此，在本研究中，TGF-β1可誘導肺腺癌PC9細胞發生EMT，且為不完全EMT。

TGF-β可通過酪氨酸激酶受體迅速激活PI3K/AKT信號通路[17,18]。PI3K激酶調節亞基已被證實與TβRI和TβRII受體相關，并可提高TGF-β的激活效果[19]。PI3K/AKT信號通路的阻斷可抑制TGF-β誘導的細胞形態學變化，并使a-SAM表達下調和E-cadherin表達上調[20,21]。由此可見，在EMT過程中，TGF-β在PI3K/AKT信號通路的激活中起重要作用。Chao等[22]指出經TGF-β處理的腫瘤細胞的p-AKT表達量在4 h時達到高峰，之后其表達量逐漸減低。我們用TGF-β1處理PC9細胞48 h后p-AKT的表達量較未處理組明顯減少，而1 ng/mL組和5 ng/mL組的減少量并無差別，可推測PC9細胞在TGF-β1的刺激下，p-AKT的表達隨時間的變化而發生改變，但與TGF-β1濃度關系不大。

總而言之，TGF-β1可誘導肺腺癌PC9細胞發生不完全EMT，并影響PI3K/AKT信號通路。已證實PI3K/AKT信號通路參與胃癌的侵襲轉移[23]，那么此通路對肺腺癌PC9細胞的侵襲轉移能力又有何影響，還需進一步研究。