應用組織芯片法檢測EGFR、COX-2在肺癌中的表達及生物學意義

朱叢中 劉娟 王新允

肺癌是一種嚴重威脅人類健康與生命安全的疾病，其發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。表明表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在大多數實體腫瘤中高表達，可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及腫瘤血管生成[1]。環氧合酶-2 （cyclooxygenase-2,COX-2）在多種癌前病變、惡性腫瘤和轉移癌中的表達均異常升高，并且升高的水平與腫瘤的生長、侵襲和預后有關[2]。檢測兩者在肺癌中的表達及相關性，并探討它們與肺癌各臨床參數之間的關系，對肺癌的診斷、預后判斷和治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標本 收集天津醫科大學總醫院及第二附屬醫院病理科1987年-2003年手術切除的肺癌石蠟包埋標本，其中原發肺癌89例，淋巴結轉移性肺癌12例，肺癌癌前病變12例。患者術前均未行放療及化療。原發肺癌中包括腺癌35例，鱗癌33例，小細胞癌12例，大細胞癌9例；男性67例，女性22例；年齡33歲-78歲，平均年齡60.28±9.48歲；周圍型肺癌59例，中央型肺癌30例；高-中分化53例，低-未分化36例；I+II期56例，III+IV期33例；有淋巴結轉移者48例，無淋巴結轉移者41例。收集10例正常肺組織作為對照組。

1.1.2 試劑 兔抗人EGFR單克隆抗體（ZA-0505，工作液）、兔抗人COX-2單克隆抗體（ZA-0515，工作濃度1:80）、SP-9000試劑盒（包括封閉用山羊血清，生物素標記二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素）和DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 由于組織芯片技術是將數十或百個組織片排列于一張切片上，可以同時研究細胞形態、特定基因蛋白在樣本中的表達和功能狀態，并且實驗一次完成，實驗條件一致，大大降低了實驗誤差，增加了結果的可比性和可重復性，特別適用于臨床病理研究中，因此本次研究設計采用了該方法。制作方法如下：選取存檔蠟塊，切片，HE染色，病理專家復診，對蠟塊定位。美國Beecher陣列儀在受體蠟塊上按陣列圖打孔，組織芯直徑為0.6 mm，原發性肺癌和正常肺組織每例取2芯，淋巴結轉移性肺癌和癌前病變每例取3芯。用穿刺針將標記好的供體組織芯取出，轉移到受體蠟塊相應位置制成組織芯片蠟塊。采用3 μm切片[3]，切片后組織芯均勻排布于載玻片上，無脫片，也無明顯移位及扭曲。

圖 1 EGFR在肺癌組織中的表達（SP, ×200）Fig 1 The expression of EGFR protein in lung cancers (SP, ×200)

1.2.2 免疫組化SP法 切片脫蠟水化后，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，0.1%枸櫞酸緩沖液（pH6.0-6.2）中微波修復20 min，山羊血清封閉15 min，滴加一抗，4oC冰箱過夜。第二天切片恢復室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素，分別37oC下孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。滴加PBS取代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判定 EGFR陽性表達位于細胞膜和細胞漿（圖1），COX-2定位于細胞漿（圖2）。根據免疫組化染色強度及陽性細胞數量進行半定量評分[4]，其中染色強度以多數細胞著色深淺計算：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；陽性細胞數＜10%為0分，10%-45%為1分，46%-65%為2分，＞65%為3分；染色強度及陽性細胞數得分相乘，0為陰性（-），1分-2分為弱陽性（+），3分-4分為陽性（++），5分-6分為強陽性（+++）。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件包進行數據分析。各組陽性率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，各指標表達水平的比較采用非參數檢驗（Mann-Whitney檢驗或Kruskal-Wallis檢驗），EGFR和COX-2表達的相關性分析采用Spearman等級相關，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖 2 COX-2在肺癌組織中的表達（SP, ×400）Fig 2 The expression of COX-2 protein in lung cancers (SP, ×400)

2.1 EGFR的表達情況 EGFR在各組的陽性表達率為原發性肺癌組59.6%（53/89），癌前病變組41.7%（5/12），淋巴結轉移性肺癌組66.7%（8/12），正常肺組織組為10.0%（1/10），四組間EGFR的陽性表達率有統計學差異（P＜0.05），淋巴結轉移性肺癌組＞原發性肺癌組＞癌前病變組＞正常組。EGFR的表達在肺癌的組織學類型、臨床分期和有無淋巴結轉移各組間有統計學差異（P＜0.01），其中大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌＞小細胞癌，臨床III+IV期＞I+II期，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組。EGFR的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢，合并分期后III+IV期高于I+II期（U=474.500, P＜0.001）。EGFR的陽性表達率與肺癌的大體類型、組織學分級、性別和年齡無關（P＞0.05）。見表1。

2.2 COX-2的表達情況 COX-2的陽性表達率為原發性肺癌組52.8%（47/89），癌前病變組41.7%（5/12），淋巴結轉移性肺癌66.7%（8/12），正常組為0（0/10），淋巴結轉移性肺癌組＞原發性肺癌組＞癌前病變組＞正常組，四組間的COX-2的陽性表達率有統計學差異（P＜0.01）。COX-2的表達在肺癌的大體類型、組織學類型、臨床分期和有無淋巴結轉移各組間有統計學差異（P＜0.05），其中周圍型肺癌＞中央型肺癌，大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌＞小細胞癌，臨床III+IV期＞I+II期，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組。COX-2的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢，合并分期后III+IV期高于I+II期（U=680.500, P=0.026）。COX-2的陽性表達率與肺癌的組織學分級、性別和年齡無關（P＞0.05）。見表1。2.3 EGFR和COX-2表達的相關性 EGFR與COX-2在肺癌組織中的表達成正相關（rs=0.495, P＜0.01）。

表 1 EGFR和COX-2的表達及與臨床病理學參數的關系Tab 1 Associations between expression of EGFR and COX-2 and clinicopathologic parameters

3 討論

EGFR是ErbB受體酪氨酸激酶家族的成員之一，它是一個分子量為170 kDa的單跨膜酪氨酸激酶，其編碼基因位于染色體7p13-q22，通過與相應配體如表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）或轉化生長因子-α（transforming growth factor-α, TGF-α）結合，EGFR被活化，其與自身分子發生同二聚體化或與同家族的其它分子發生異二聚體化，導致EGFR胞漿部分的特定酪氨酸殘基磷酸化，并刺激下游信號傳導通路的活化，從而調控細胞的增殖、轉移、黏附、分化以及存活[5,6]。

文獻報道，在膀胱癌[7]、骨肉瘤[8]、膽道腫瘤[9]等多種實體瘤組織中存在EGFR基因的擴增或蛋白的高表達。本研究中EGFR在淋巴結轉移性肺癌、原發性肺癌和癌前病變中高表達，在正常肺組織中低表達，提示EGFR與腫瘤的發生關系密切，其異常表達可能是肺癌發生的關鍵因素之一。最近的研究[10]表明肺腺癌中EGFR基因拷貝數增加和EGFR蛋白的過表達，此結果與我們的研究結果相符。因此檢測EGFR在肺癌中的表達情況對肺癌的臨床診斷有重要的指導作用。我們還發現EGFR的表達與肺癌的組織學類型密切相關，大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌高于小細胞癌，提示EGFR在肺癌中的過表達存在組織學特異性，不同組織學類型肺癌的發病機理可能不同，因而治療手段和方案也各異，這就為肺癌的診斷和針對性治療提供了一定的依據。

本研究結果顯示晚期肺癌患者EGFR的陽性表達率高于早期患者，并且隨著臨床分期的增加EGFR水平增強。EGFR表達還與肺癌淋巴結轉移密切相關，有淋巴結轉移患者的表達率高于無淋巴結轉移者。這些發現均提示EGFR與肺癌的侵襲和轉移密切相關。Kim等[11]報道EGFR是估計胃癌預后的獨立指標，過表達者主要為晚期患者，其緩解期和生存期都明顯短于陰性表達者。我們推測EGFR它可能通過增強瘤細胞增殖能力、調控腫瘤細胞的粘附、腫瘤性血管生成而促進肺癌轉移，對肺癌患者進行EGFR表達的檢測將有助于患者的預后評估。

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素過程中的一個重要限素酶，研究[2]表明它與腫瘤的發生、進展、侵襲和血管生成密切相關。本研究顯示，COX-2在癌前病變組、原發性肺癌組和淋巴結轉移性肺癌組中表達率依次升高，并明顯高于正常肺組織，提示COX-2可促進肺癌的發生和進展。尤其在非小細胞肺癌中COX-2呈高表達，小細胞肺癌中表達陰性，提示COX-2在非小細胞肺癌發生發展中起重要作用。本研究結果還顯示周圍型肺癌中COX-2的表達水平明顯高于中央型肺癌組，其原因可能是周圍型肺癌多為大細胞癌和腺癌，中央型肺癌多為鱗癌。我們的結果也證實大細胞癌＞腺癌＞鱗癌，兩結果彼此相符。因此從肉眼類型也反映了不同類型肺癌中COX-2的作用不同，為不同類型肺癌的臨床診斷和治療提供了思路。本研究結果還顯示晚期患者以及伴淋巴結轉移患者COX-2陽性表達率升高，并且COX-2的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢。文獻[12,13]報道COX-2的表達與腫瘤的分級、高增殖率、低凋亡指數有關，高表達患者預后較差。我們研究的結果和文獻報道一致，提示COX-2與肺癌的臨床進展密切相關，可作為預測預后的重要指標，臨床檢測COX-2的表達有助于患者治療方案的選擇和預后評估。

COX-2和EGFR的激活與調節均與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等信號通路有關，通過這些信號通路COX-2和EGFR之間的關系似乎就建立起來。迄今為止，國內外許多研究者[1,14]對兩者之間的關系作了一系列研究，發現COX-2和EGFR之間可能存在復雜的相互調控關系，COX-2可以被EGFR活化而激活，COX-2表達的增加可以增加前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）的產生，而 PGE2可以轉而活化EGFR。Vallbohmer等[15]的研究結果證實，COX-2、EGFR和白細胞介素-8（interleukin-8, IL-8）的表達與西妥昔單抗（cetuximab，愛必妥）單一治療后患者總的生存率有關，三者低表達的患者存活時間明顯長于高表達者。我們通過對COX-2和EGFR進行檢測，發現兩者的表達呈正相關，結果與文獻報道一致。本研究結果顯示COX-2和EGFR均可以調節肺癌的發生和發展，并且兩者之間存在相互調控作用。因此，COX-2和EGFR在肺癌發生、發展、浸潤和轉移過程中起重要作用，檢測EGFR和COX-2的表達有助于肺癌的臨床診斷和預后評估。