SHP2在非小細胞肺癌中的表達及意義

唐春蘭 周向東 楊和平 王清良 章容

蛋白酪氨酸磷酸化在細胞信號轉導過程中具有重要作用，酪氨酸磷酸化水平受控于蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）及蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase, PTP），二者的失衡會導致異常的酪氨酸磷酸化，而異常的酪氨酸磷酸化與人類多種疾病包括癌癥的發(fā)生密切相關，許多PTPs參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此是潛在的癌癥藥物治療靶點[1]。SHP2（Src homology phosphotyrosyl phosphatase 2） 為含有兩個 SH2（Src homology-2）域的蛋白酪氨酸磷酸酶，是PTP超家族中第一個癌基因SHP2基因的蛋白產(chǎn)物，在細胞生長、生存、侵襲、遷移、轉化、形態(tài)發(fā)生中具有重要作用。研究[2-5]表明，SHP2的突變與努南綜合征和豹斑綜合征的發(fā)生密切相關，SHP2的活化突變也是多種血液系統(tǒng)腫瘤的病因，且在乳腺癌中也有SHP2的高表達[6]，但目前尚無SHP2與肺癌關系的研究報道。本文采用組織芯片及免疫組化技術，以探討SHP2在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理 共收集2005年9月-2007年3月第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院胸外科肺癌手術標本83例（其中鱗癌44例，腺癌24例，肺泡細胞癌8例，腺鱗癌5例，大細胞癌1例，神經(jīng)內分泌癌1例）；另從本院病理研究所檔案材料中選取2003年-2004年手術肺癌石蠟包埋組織26例（其中腺癌21例，鱗癌5例）。從上述109例病例中隨機選取鱗癌40例，腺癌40例，另取正常肺組織10例。其中男性68例（鱗癌38例，腺癌30例），女性12例（鱗癌2例，女性10例）；分化程度：I級21例（其中鱗癌10例，腺癌11例），II級52例（其中鱗癌28例，腺癌24例），III級7例（其中鱗癌2例，腺癌5例）；有淋巴結轉移者72例（其中鱗癌37例，腺癌35例），無淋巴結轉移者8例（其中鱗癌3例，腺癌5例）；臨床分期：I期8例（其中鱗癌3例，腺癌5例），II期20例（其中鱗癌9例，腺癌11例），III期52例（其中鱗癌28例，腺癌24例）。另選10例非肺部疾病死亡尸檢肺組織作對照。患者術前均未經(jīng)過化療及放療。

1.2 主要試劑 鼠抗人SHP2單克隆抗體購自Santa Cruz公司。組織芯片儀購自美國Beecher Instruments公司。載玻片（上海精輪工業(yè)玻璃有限公司）用1:10的多聚賴氨酸溶液處理。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片的制作 在HE切片上選擇癌組織、癌旁組織各兩點，對照切片，在石蠟塊上進行相應標記。制作受體蠟塊，平整蠟塊表面，厚度以1.0 cm-1.2 cm為宜。把受體蠟塊固定在固定槽中，調節(jié)X、Y軸上微量標尺指示器為零，調節(jié)組織芯片儀左邊的距離定位螺絲，確定打孔深度為3 mm，然后向下打孔。移走細針，用粗針對準預先做好的標記，挖取供體組織。然后將粗針里的供體組織放入受體蠟塊的孔中。全部點樣完畢，將組織芯片蠟塊放入37oC烤箱中15 min。取出后，用載玻片平整蠟塊表面，然后按照常規(guī)石蠟切片方法進行切片，裝盒備用。

1.3.2 免疫組化染色及結果判定 采用SP法進行免疫組化染色。一抗為SHP2抗體。PBS替代一抗作空白對照，正常肺組織作正常對照。按著色強度分為：陰性（-），無陽性細胞；弱陽性（+），呈淺黃色；中度陽性（++），呈棕黃色；強陽性（+++） ，呈棕褐色。（+）-（+++）計為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，組間資料比較采用χ2檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片構建情況 成功構建了含有340個點（每例各取癌組織2點，癌旁組織2點，正常肺組織每例各取2點）的NSCLC組織的微陣列蠟塊，由此切片得到NSCLC組織芯片（圖1）。各點組織的形態(tài)結構均有很好的代表性，可反映原病理切片的結構特點。

2.2 免疫組化結果

2.2.1 SHP2染色結果 SHP2主要表達于腫瘤細胞的細胞質中（圖2），癌旁組織和正常對照組無陽性表達。

2.2.2 SHP2陽性表達與性別、年齡、腫塊大小、病理類型、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期的關系 SHP2在男性/女性患者的陽性表達率分別為72.06%（49/68）和58.33%（7/12），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.495）；在大于或等于/小于55歲的患者中，SHP2的陽性表達率分別為78.05%（32/41）和61.54%（24/39），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.144）；在腫塊大小上，在腫塊直徑大于或等于/小于3 cm的患者中，SHP2的陽性表達率分別為70.66%（53/75）和60.00%（3/5），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.633）；SHP2在鱗癌/腺癌的陽性表達率為分別為72.50%（29/40）和67.50%（27/40），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.808）；分化程度為I+II級/III級的患者SHP2的陽性表達率分別為69.86%（51/73）和71.43%（5/7），差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000）；臨床分期為I+II期/III期的患者SHP2的陽性表達率分別為57.14%（16/28）和76.92%（40/52），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.078）；有/無淋巴結轉移的患者SHP2的陽性表達率分別為73.61%（53/72）和37.50%（3/8），有統(tǒng)計學差異（P=0.048）。提示MMP-2、MMP-9陽性表達與NSCLC患者的性別、年齡、腫塊大小、病理類型、分化程度、臨床分期無關，而與淋巴結轉移相關（見表1）。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中約有80%為NSCLC。盡管近年來對肺癌的病因、發(fā)病機制、診斷及治療取得了一定進展，但目前肺癌的5年生存率卻仍然較低，因此，探索肺癌的病因、發(fā)病機制、尋找新的治療靶點及標志物具有重要意義。

研究[3,4]表明，SHP2的活化突變是青少年粒-單核細胞性白血病、髓細胞性白血病、慢性粒-單核細胞性白血病的病因；它也參與幽門螺旋桿菌相關胃癌的發(fā)生[7]；在乳腺癌中也有SHP2的高表達（72%），且SHP2的表達與乳腺癌的淋巴結轉移、分化程度密切相關，有淋巴結轉移、分化程度越低的患者SHP2的表達越高，在SHP2過表達的乳腺癌病例，HER2也過表達[6]，且抑制SHP2的表達可使間充質細胞向正常上皮細胞轉化[8]。因此，SHP2有望成為多種白血病及實體瘤包括乳腺癌新的標志物及治療靶點，目前也已開展SHP2抑制劑的研究[9]，但至今尚無SHP2與肺癌關系的研究報道。

圖 1 組織芯片F(xiàn)ig 1 Tissue microarray

組織芯片技術最早由Kononen等于1998年建立并報道，具有高產(chǎn)出、實驗誤差小、方便經(jīng)濟、對原始組織蠟塊損壞小等優(yōu)點，現(xiàn)已得到廣泛的應用，研究內容包括膀胱移行細胞癌、結直腸癌、肺癌、人腦膠質細胞瘤。本實驗共選取80例NSCLC患者的肺癌標本制作組織芯片，結合免疫組化方法，首次方便、快速、高效地檢測了SHP2在NSCLC中的表達，并探討其與肺癌患者性別、年齡、腫塊大小、組織類型、分化程度和有無淋巴結轉移以及臨床分期的關系。

圖 2 SHP2在鱗癌、腺癌和正常組織中的表達（SP×400）A：SHP2在鱗癌組織中表達強陽性； B：SHP2在腺癌組織中表達強陽性；C：SHP2在正常組織中無陽性表達。Fig 2 Expression of SHP2 in squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and normal tissue (SP×400)

表 1 SHP2的表達水平與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系Tab 1 The relationship between SHP2 expression and clinicopathological characteristics in non-small cell lung cancer

本研究結果顯示，SHP2在NSCLC中有較高陽性表達率[70.00%（56/80）]，其中鱗癌為72.5%（29/40），腺癌為67.50%（27/40），而在癌旁組織及正常肺組織中無表達，提示SHP2在NSCLC中的表達具有較高的特異性和敏感性，SHP2可作為NSCLC新的標志物，且可能與預后相關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SHP2在NSCLC中的表達與性別、年齡、腫塊大小、組織類型無關，提示未來針對SHP2靶點的NSCLC治療有較廣泛的適宜人群。

肺癌患者的高死亡率與遠處臟器轉移如肝、骨、腦、心包轉移密切相關，而淋巴結狀態(tài)是預測轉移的有效手段之一。本研究結果顯示，SHP2在有淋巴結轉移組的陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組，盡管目前沒有SHP2促進腫瘤轉移的在體數(shù)據(jù)，但許多體外研究[10-13]表明，SHP2可促進細胞的運動、粘附及遷移，SHP2在細胞生長、生存、轉化、形態(tài)發(fā)生中的也具有重要作用，提示SHP2可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。結合SHP2在NSCLC中的特異高表達，進一步提示SHP2有可能成為肺癌新的治療靶點及預后標志物，進一步研究其與肺癌的關系有望成為肺癌研究領域新的熱點。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)SHP2的表達雖與淋巴結轉移相關，但卻與臨床分期及分化程度無關，這似乎矛盾，但從表達率來看，III期NSCLC仍明顯高于I+II期NSCLC，統(tǒng)計學無差異可能與病例數(shù)不夠多和病例分期及病理分級不平衡有關，今后可擴大病例數(shù)進一步研究。