維生素C對A549細胞增殖、凋亡及Caspase-3、Survivin表達的影響

翟鵬勇 曾錦榮 譚寧 王績英 黃嵐珍 佘巍巍

維生素C（Vitamin C, Vit C）是一種具有6個碳原子的酸性多羥基化合物。其分子中2位和3位碳原子的兩個烯醇式羥基極易解離，釋放出H+，而被氧化成脫氫Vit C。Vit C和脫氫Vit C在人體內形成可逆的氧化還原系統，此系統在生物氧化、還原作用及細胞呼吸中起重要作用。Vit C作為細胞保護劑廣泛應用于臨床多種疾病（如壞血病、肝硬化等）的治療。近年來，研究[1]發現Vit C可以促進腫瘤細胞的凋亡，但具體機制尚未完全闡明。本研究將探討Vit C對肺癌A549細胞株的增殖、凋亡的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與實驗分組

1.1.1 實驗材料 肺癌細胞株A549由中山大學附屬腫瘤醫院惠贈，DMEM培養液（GIBICOL公司），小牛血清（GIBICOL公司），Vit C（廣州南國藥業有限公司），CCK-8試劑（大連寶生物有限公司），RT-PCR反應體系（Promega公司），Caspase-3 mRNA及Survivin mRNA引物由上海賽百盛生物技術有限責任公司合成。

1.1.2 實驗分組 以50×D/5 000×2×103公式[2]計算出Vit C臨床用藥量為400 μg/mL。實驗分為對照組及40 μg/mL、400 μg/mL、4 mg/mL三種濃度Vit C組。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞置于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，在37oC、5%CO2培養箱中傳代培養。每兩天換一次液，4 d傳代。

1.2.2 細胞增殖測定（CCK-8法） 取指數期A549細胞，待生長至近融合狀態，經0.25%EDTA的PBS消化后，配成5 000/mL，然后將細胞以1 000/孔接種于96孔板，置于CO2培養箱培養24 h后加藥，在培養箱中繼續培養24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h后，加入10 μL CCK-8混合液，震蕩10 s，繼續培養2 h后吸出上清液450 nm測OD值，繪制生長曲線。

1.2.3 細胞集落形成測定（克隆形成法） 取對數生長期的A549細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，離心后，把細胞重懸在10%胎牛血清的DMEM培養液中備用。將細胞懸液稀釋成500個/mL，以1 000/孔接種于6孔板中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37oC、5%CO2培養箱培養1周，當培養皿中出現鏡下可見的克隆時，加入以上濃度藥物培養1周。終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加適量結晶紫應用染色液染30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，并在顯微鏡（低倍鏡）計數大于20個細胞的克隆數。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡率 用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度為1×106/mL接種于10 cm皿中，置于5%CO2、37oC培養箱中培養12 h后，用含0.5%小牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h，使細胞周期同步化。加入Vit C（400 μg/mL），對照組不加藥，分別作用6 h、12 h、24 h、48 h，收集貼壁細胞，制成單細胞懸液，70%乙醇固定，4oC保存過夜，-20oC保存（有效期為1周）。檢測前用PBS洗去固定液，加入20 μL RnaseA，37oC孵育30 min后，暗處加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目篩網過濾。調整細胞濃度為1×105/mL-1×106/mL，采用流式細胞儀檢測，激發光源為氬離子，激發波長488 nm，用Multicycle DNA分析軟件行細胞周期的測定。

1.2.5 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA的表達水平 取對數生長期A549細胞加入400 μg/mL的Vit C作用6 h、12 h、24 h、48 h后TRIzol一步法提取總RNA，取1 μL總RNA以10 μL體系逆轉錄，制備cDNA，并稀釋30倍備用。Caspase-3 mRNA上游引物：5’-TGACCGAGGC TACATTCAGATGACACC-3’，下游引物：5’-CAAGAGAG TTGGGCTGACCAGAAACAC-3’，擴增產物365 bp；Survivin mRNA上游引物：5’-CCCTTTCTCAAGGACCACC GCATC-3’，下游引物：5’-CACTGAGAACGAGCCAGACT TGGC-3’，擴增產物133 bp；β-actin上游引物：5’-AGTGT GACGTGGACATCCGCA-3’，下游引物：5’-ATCCACAT CTGCTGGAAGGTGGAC-3’，擴增產物243 bp。擴增后取擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。應用凝膠成像系統對電泳條帶進行掃描分析，計算相對表達水平（與β-actin比值）。

1.2.6 統計分析 所有實驗均重復3次，用Mean±SD表示，經SPSS 10.0進行兩兩比較的t檢驗，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 細胞增殖情況及生長曲線 以40 μg/mL、400 μg/mL、4 mg/mL三種濃度Vit C干預A549抑制增殖情況見圖1，結果表明400 μg/mL Vit C、4mg/mL Vit C明顯抑制A549的增殖（P＜0.05），而40 μg/mL Vit C抑制作用不明顯（P＞0.05）；隨著濃度的增大，3天抑瘤率明顯增大，見圖2。

2.2 細胞集落形成觀察 A549細胞分別加入40 μg/mL Vit C、400 μg/mL Vit C、4 mg/mL Vit C，肉眼克隆見圖3A，鏡下計數見圖3B，400 μg/mL Vit C、4mg/mL Vit C組明顯抑制了肺癌A549細胞克隆的形成，與對照組、40 μg/mL Vit C 組相比有統計學差異（P＜0.05）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡實相結果 圖4可見，臨床用藥量（400 μg/mL）的Vit C隨著作用時間的延長，G0/G1期、S期的細胞明顯增多，進入G2/M期的細胞明顯減少，說明Vit C可以延長A549的細胞周期，從而抑制其增殖，當作用24 h、48 h后G0/G1期、S期的細胞明顯增多，并且隨著作用時間的延長細胞凋亡數明顯增加。

2.4 RT-PCR檢測Vit C對Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA水平的影響 取對數生長期A549細胞，加入400 μg/mL的Vit C培養6 h、12 h、24 h、48 h后提取總RNA進行RTPCR，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明Vit C作用6 h后Caspase-3 mRNA的表達增高，隨著作用時間的延長表達量無明顯增多（P=0.001、0.002、0.002、0.003）；隨著Vit C作用時間的延長，Survivin mRNA的表達并未明顯變化（P=0.959、0.552、0.23、0.173），見圖5。

圖 1 不同濃度Vit C作用A549細胞生長曲線對照組 vs Vit C（40 μg/mL）組：P＞0.05；對照組 vs Vit C（400 μg/mL、4 mg/mL）組：P＜0. 05；Vit C（40 μg/mL）組 vs Vit C（400 μg/mL、4 mg/mL）組：P＜0.05。Fig 1 Cell proliferation curve of A549 cell with Vit C at different doses Control group vs Vit C (40 μg/mL) group: P＞0.05;Control group vs Vit C (400 μg/mL, 4 mg/mL) group: P＜0.05;Vit C (40 μg/mL) group vs Vit C (400 μg/mL, 4 mg/mL) group: P＜0.05.

圖 2 不同濃度Vit C作用A549瘤生長抑制率（第3天）隨著Vit C濃度的增加，對A549第3天的生長抑制率也隨著增高。Fig 2 Ratio of inhibition of A549 cell with Vit C at different doses (d3)The ratio of inhibition of A549 cell increased with the increase in the concentration of Vit C.

3 討論

圖 3 不同濃度Vit C作用A549后集落形成數Vit C（400 μg/mL）組、Vit C（4 mg/mL）與對照組及Vit C（40 μg/mL）組比明顯抑制A549集落形成（P＜0.05）。Fig 3 Colony of A549 cell with Vit C at different doses Compared with control group and Vit C group, Vit C (400 μg/mL) group and Vit C (4 mg/mL) group inhibited A549 colonies (P＜0.05).

Vit C是具有許多生物學功能的水溶性己糖衍生物，它的分子式是C6H8O6，其分子中2位和3位碳原子的兩個烯醇式羥基極易解離，釋放出H+。通常情況下，我們普遍認為小劑量Vit C是天然抗氧化劑，通過還原作用清除氧自由基，而大劑量Vit C具有氧化作用[3-4]。而研究也主要集中于Vit C在小劑量時對腫瘤發生的預防作用，對腫瘤的治療作用的研究還處于初始階段。本研究發現Vit C在400 μg/mL時即可以明顯抑制肺癌A549細胞的增殖（P＜0.05），流式細胞儀檢測發現400 μg/mL Vit C可以將A549細胞阻滯在G0/G1期及S期，使進入G2/M期的細胞明顯減少，從而延長了細胞周期，并且發現隨著作用時間的延長，可以明顯促進A549細胞的凋亡。

圖 4 400 μg/mL Vit C干預A549細胞不同時間后流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期變化結果與對照組、6 h、12 h組比較，24 h組、48 h組A549細胞明顯被阻滯在G0/G1期和S期，凋亡率明顯增加（P＜0.05）。Fig 4 Changes of cell cycle and apoptosis after 400 μg/mL Vit C treated A549 cell different time Compared with control group, 6 h and 12 h groups, 48 h and 24 h groups blocked A549 cells in G0/G1 and S phase, and induced apoptosis markably (P＜0.05).

圖 5 400 μg/mL Vit C干預A549細胞不同時間對Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表達的影響Vit C作用6 h后Caspase-3 mRNA的表達增高，隨著作用時間的延長表達量無明顯增多；隨著Vit C作用時間的延長Survivin mRNA的表達未見明顯變化。Fig 5 Expression of Caspase-3 mRNA, Survivin mRNA after 400 μg/mL Vit C treated A549 cell different time The relative expression of Caspase-3 mRNA up-regulated when Vit C treated A549 cell 6 hours later and it no longer changced with time prolonged; the relative expression of Survivin mRNA was not significant change after Vit C treated A549 cell.

眾所周知，凋亡逃逸是腫瘤發生、發展的重要機制之一。細胞凋亡主要通過線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路啟動凋亡。線粒體通路主要是含BH3結構域的Bcl-2家族成員與另外的Bcl-2家族成員（Bax亞家族成員Bax、Bak）等作用，導致后者的寡聚并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，釋放細胞色素C（Cyt C）和其它蛋白[5]，Cyt C在ATPPdATP存在的情況下，Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease activating factor, Apaf-1）形成多聚復合體，通過Apaf-1氨基端的Caspase募集結構域（caspase recruitment domain,CARD）募集胞質中的Caspase-9前體，并使其自我剪切活化并啟動Caspase級聯反應，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡[6]；死亡受體通路主要機制是死亡配體與死亡受體激活無活性的pro-caspase-8變為有活性的Caspase-8。激活的Caspase-8不僅可激活下游效應Caspase裂解多種蛋白質而最終導致細胞凋亡，同時還可以降低線粒體內膜電位使Bc1-2家族成員裂解，導致Cyt C的釋放[7]，后者可與Apaf-1結合，在dATP的存在下活化Caspase-9，Caspase-9能激活下游效應Caspase-3[8]。而Caspase-3作為這兩條通路上的下游共同基因，在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用。本研究發現，隨著作用時間的延長Vit C可以上調Caspase-3的表達，提示Vit C可能通過氧化作用進一步減少腫瘤細胞內本來就缺乏的過氧化物酶，并增加過氧化氫（H2O2）的產生[9]從而作用于pro-caspase激活Caspase-3誘導A549細胞凋亡。而作為最強的凋亡抑制基因，Survivin在腫瘤逃逸凋亡過程中有著不可忽視的作用，可直接與Caspase-3、Caspase-7結合并抑制它們的活性[10]而阻止腫瘤細胞凋亡的發生。本研究亦觀察了Vit C對Survivin的影響，發現其并不明顯下調Survivin mRNA的表達。因此我們認為，Vit C可能雖然未能下調Survivin mRNA的表達，但可能阻止Survivin蛋白與Caspase-3的結合，從而影響腫瘤細胞的凋亡過程。綜上所述，我們認為在臨床治療量的Vit C即可以明顯抑制肺癌A549的增殖，并將其阻滯在G0/G1期及S期，并且隨著作用時間的延長，可以明顯誘導肺癌A549的凋亡，其機制可能是通過上調Caspase-3的表達。因此，我們有理由相信Vit C作為腫瘤化療的輔助用藥在臨床應用中有廣闊的前景。