淫羊藿苷對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖功能的影響

杜海斌馬 華* 武麗萍申 靜宮建芳

淫羊藿苷對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖功能的影響

杜海斌1馬 華2* 武麗萍3申 靜1宮建芳1

目的 淫羊藿苷對體外培養(yǎng)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖的影響。方法 采用密度梯度離心法分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用添加VEGF、FGF的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)7d后，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀鑒定為EPCs。用不同濃度藥物干預(yù)培養(yǎng)EPCs，分別作用不同時(shí)間（24、48、72h）后，倒置相差顯微鏡下觀察EPCs生長情況，四唑藍(lán)比色試驗(yàn)（MTT法）測定EPCs的吸光度值。用西藥西辛伐他汀作為對照組。結(jié)果 與對照組比較，淫羊藿苷高、中、低濃度組均改善了EPCs增殖功能（P＜0.05），且呈一定的量效、時(shí)效關(guān)系，在中濃度最為顯著（P＜0.05）能明顯促進(jìn)增殖能力；在同一濃度組中，隨時(shí)間延長淫羊藿苷對EPCs的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，于72h達(dá)到高峰，且中藥中劑量組對EPCs的促進(jìn)作用優(yōu)于西藥組辛伐他汀組。結(jié)論 淫羊藿苷能促進(jìn)EPCs增殖，從而刺激缺血組織血管新生和再生，可能是其防治心腦血管及周圍血管疾病的機(jī)制之一。

淫羊藿苷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；增殖

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為血管母細(xì)胞，其表面標(biāo)志性抗原為CD34+。內(nèi)皮祖細(xì)胞主要存在于骨髓、臍血

和外周血中。EPCs功能主要體現(xiàn)在其能在一定條件下，在機(jī)體缺血區(qū)、組織損傷部位形成新生血管，促進(jìn)血流恢復(fù)和創(chuàng)傷修復(fù)[1,2]。本研究通過觀察淫羊藿苷對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖及功能的調(diào)控作用，及其可能的量效、時(shí)效關(guān)系，旨在探討淫羊藿苷可能的內(nèi)皮保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

淫羊藿苷藥物：淫羊藿苷，又名淫陽藿黃酮苷，分子式C33H40O15。由中國藥品生物制品檢定所提供；辛伐他汀純品（由Sigma公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離、培養(yǎng)

采取健康成人志愿者空腹外周血，每人40mL，肝素抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液、PBS、添加VEGF、FGF的M199培養(yǎng)液，分離培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。

表1 淫羊藿苷與對照組EPCs 增殖比較（χ—±s）

1.2.2 EPCs細(xì)胞表型鑒定

①激光共聚焦顯微鏡觀察收集的貼壁細(xì)胞。②流式細(xì)胞儀分析檢測。

1.2.3 MTT法檢測EPCs活性

取培養(yǎng)7d的EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化后收集，制成細(xì)胞懸液，以1×104/mL細(xì)胞密度接種，每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)24h后，按照ICA藥液濃度將培養(yǎng)板分4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔和空白對照：分別為辛伐他汀組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，5%CO2孵箱37℃分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加20μL MTT試劑培養(yǎng)，4h后棄上清，再加入二甲基亞砜每孔100μL，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長490nm處測吸收度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以χ—±s表示，組間資料比較采用ANOVA，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的鑒定及CD34、CD133的表達(dá)

用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I對EPCs染色后，通過激光共聚焦顯微鏡鑒定，流式細(xì)胞儀示貼壁細(xì)胞表達(dá)CD34陽性率為（56.91±3.84）%，CD133陽性率為（23.68±0.99）%。

2.2 不同濃度淫羊藿苷對人外周血EPCs增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示(表1)，淫羊藿苷顯著增加EPCs 的增殖能力，EPCs 分別與不同濃度淫羊藿苷培養(yǎng) 24、48、72h 后測得，3種濃度淫羊藿苷在同一作用時(shí)間內(nèi)均可使 EPCs 吸光度值（OD）增高，與對照組比較，均有顯著差異（P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。中濃度淫羊藿苷組OD值增加明顯（P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。同一濃度淫羊藿苷作用24、48、72h 3種時(shí)間內(nèi)，OD值隨時(shí)間推移逐漸增高，EPCs的增殖能力在淫羊藿苷刺激后48h開始明顯改善，于72h達(dá)到高峰（P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），西藥組在3d作用時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的推移，OD值逐漸增高，同一作用時(shí)間，測得的OD值高于低、高劑量濃度淫羊藿苷組，但低于中濃度劑量組，低、中濃度劑量的淫羊藿苷與西藥組辛伐他汀比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度淫羊藿苷組與辛伐他汀組無統(tǒng)計(jì)學(xué)比較意義。

3 討 論

2005年版藥典[3]規(guī)定以葉片中淫羊藿苷、總黃酮含量分別不得低于0.5%、5%為內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。中藥淫羊藿《本草》曰：補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力，堅(jiān)筋骨，益精氣。“腎主骨生髓”，只有腎中經(jīng)氣充盈，才能充盈骨髓，EPCs來源于骨髓，因而可以推測補(bǔ)腎活血對于EPCs具有動(dòng)員作用。

過去人們認(rèn)為成人血管僅由血管新生來維持及修復(fù)，1997年Asahara等[5]首次分離并證實(shí)人類出生后的外周循環(huán)血液中，存在能分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管EPCs，循環(huán)EPCs的發(fā)現(xiàn)證實(shí)出生后血管生成的存在。EPC不僅參與生理性血管形成，在多種病理狀態(tài)下也能被動(dòng)員出骨髓而增強(qiáng)代償性血管重建。動(dòng)員的或移植的自體來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，為血管內(nèi)皮損傷或內(nèi)皮功能障礙及血管再生性相關(guān)疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。

目前，隨著對內(nèi)皮祖細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入，中醫(yī)藥對內(nèi)皮祖細(xì)胞干預(yù)的研究也已展開。但總體來說尚處于起步階段，文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道葛根素、銀杏葉提取物、白藜蘆醇、丹參、黃芪注射液均可促進(jìn)外周血EPCs 增殖，并能改善外周血EPCs 的黏附、遷移能力。中藥淫羊藿苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞干預(yù)的研究目前尚少，國內(nèi)學(xué)者[4,5]研究表明，淫羊藿苷有降低心肌耗氧量、增加冠脈流量的作用，能抑制缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的減少。丁玲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體淫羊藿苷 (ICA)能有效促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，而EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，EPCs數(shù)量增加和功能的良好發(fā)揮對于內(nèi)皮損傷后的修復(fù)及經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)術(shù)后再狹窄的防治具有重要的作用。本試驗(yàn)以辛伐他汀作為對照，來探討淫羊藿組對于體外培養(yǎng)穩(wěn)定生長的EPCs的數(shù)量的影響，從而為尋找理想的改善損傷內(nèi)皮的藥物開辟了道路，也為中西醫(yī)結(jié)合切入點(diǎn)尋找理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用四唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測到不同濃度的淫羊藿苷能顯著促進(jìn)EPCs的增殖，且中濃度劑量組增殖優(yōu)于降脂西藥辛伐他汀，并呈一定的量效、時(shí)效關(guān)系。提示淫羊藿苷通過動(dòng)員自體EPCs增殖達(dá)到治療心腦血管疾病的目的，從細(xì)胞水平證實(shí)了該藥防治心腦血管及周圍血管疾病的可能作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供了新的途徑。在實(shí)驗(yàn)中還觀察到中濃度的淫羊藿苷組較其他濃度組對EPCs增殖效果顯著，高濃度的淫羊藿苷對細(xì)胞增殖較中濃度組具有一定的減弱作用，這與中藥的雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)相吻合，其具體機(jī)制目前尚不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。以這些研究為基礎(chǔ)，有望研制開發(fā)一些具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物，將骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員到受損部位，為防治心腦血管疾病提供一種新的策略。

[1] 宋顯晶,劉斌,楊萍,等.辛伐他汀對體外培養(yǎng)人臍靜脈血內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增及黏附能力的影響[D].吉林大學(xué)碩士論文,2007.

[2] Gao SQ,FU DX,ZHANG HM.Advances in the study on thetreatment of osteoporosis with epimedium brevicornumand its compound prescription[J].Chin J Chin Material Med,1999,4(4):249-251.

[3] 鄭筱萸.中國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:267-268.

[4] 吉瑞瑞,李付英,張雪靜,等.淫羊藿苷對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(6):525-530.

[5] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et a1.Isolation of putative progenitorendothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[6] 肖剛峰,張懷勤,黃曉燕,等.丹參的兩種主要成分對培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞藥理作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24 (6):1035-1037.

[7] 肖剛峰,張懷勤,季亢挺,等.丹參素對體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響[J].華西藥學(xué)雜志,2006,21(3):232 -234.

[8] 張芙榮,陳君柱,朱軍,等.葛根素對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響[J].中國中藥雜志,2004,29(8):777-781.

[9] 顧俊,王長謙,范華驊,等.白藜蘆醇對于外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖分化的影響[J].微循環(huán)學(xué)雜志,2006,16 (3):7-10.

[10] 丁玲,樓宜嘉. 淫羊藿苷促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制研究[D].浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2007.

Effects of Icariine on Quantity and Fuction of Peripheral Blood-derived Endothelial Progenitor Cells

DU Hai-bin1, MA Hua2, WU LI-ping3, SHEN Jing1, GONG Jian-fang1
(1 Department of Chinese and Western Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
2 Department of Chinese Traditional Medicine, The Second Af fi liated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
3 Shanxi Provincial Institute of Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Objective To investigate the effects of Icariine on proliferation of endothelial progenitor cells (EPCs) derived from peripheral bloodderived. Methods The mononuclear cells were isolated from human peripheral blood by density gradient centrifugation. The laser scanning confocal microscope and the flow cytometry (FCM ) was used to determine the EPCs of human peripheral blood. The activity of EPCs was observed under reverse microscope.MTT method was used to determine the OD value of EPCs. Result Compared with control group, the Icariine decoction contained serum high, medium, low dose group increased the proliferative adility of EPCs, showing a time-and do se-effect relation. The Icariine decoction medium dosage group had the most prominent effect on proliferation(P＜0.05). Among the same Icariine decoction dosage group, The effect increased as time went by and reached peak at 72 h. Conclusion Icariine decoction drug-containing serum can premote proliferation of the endothelial progenitor cells, stimulate angiogenesis and regeneration of ischemic tissue .The results may be parts of the mechanisms of Icariine decoction to prevent and treat cardio-/cerebrovascular and peripheral vascular disease.

Icariine; Endothelial progenitor cells; Proliferation

R329.2

B

1671-8194（2010）10-0011-03

1 山西醫(yī)科大學(xué)2007級(jí)中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)碩士研究生（030001）

2 山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科（030001）

3 山西省中醫(yī)研究所（030012）

*

mahua1022@yahoo.com.cn