Wnt1在非小細胞肺癌中的表達與預后的關系

王琴 展平 于力克 宋勇

肺癌作為一種惡性腫瘤，其發病率和死亡率近年來一直呈上升趨勢，已成為21世紀全球面臨的嚴峻的健康問題[1]。在中國，據預測到2025年，肺癌患者將達到100萬，居世界第1位。肺癌的發病機制復雜，是多因素、多基因、多階段共同參與的結果，目前這方面的研究主要集中在腫瘤相關基因的克隆和功能分析、細胞信號轉導途徑及細胞周期調控三大領域，其中細胞信號轉導途徑對其發生發展起著至關重要的作用。Wnt信號通路是一種進化上高度保守的、對控制胚胎發育有重要作用的信號轉導通路。對Wnt基因家族成員的編碼產物及其生物學效應的研究發現，Wnt信號通路的異常激活參與了多種人類癌癥的發生[2]。Wnt1蛋白是Wnt通路中第一個被發現的蛋白[3]，目前關于Wnt1在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達及與術后生存期的相關性研究尚少，為此我們探討Wnt1在NSCLC組織內的表達情況及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病人資料 選取解放軍第八一醫院和南京市胸科醫院2001年1月-2005年12月手術切除的經常規病理證實的NSCLC標本115例，肺良性病變組織19例（5例肺結核、4例支氣管擴張、6例肺大皰、4例炎性假瘤）。115例NSCLC病人詳細病理特征見表1，分期采用國際抗癌聯盟1997年修訂的肺癌分期標準。全部病例術前均未作過化療或放療；73.9%的病人術后予以鉑類為基礎的2-4個療程的化療。納入的病例要求切緣陰性，術后生存3個月以上，術后5年內肺癌是其唯一死因。本研究中病人平均生存時間為22個月（3個月-82個月），隨訪的截止日期為2009年3月21日。

1.2 方法 采用免疫組化Envision方法[4]，取病理科石蠟包埋的組織，切片成4 μm，經常規脫蠟至水后，EDTA液（北京中杉金橋生物技術有限公司）高溫抗原修復，PBS沖洗1次（1 min），每張切片滴加50 μL的一抗（兔抗人Wnt1單克隆抗體，英國Abcam公司，稀釋濃度1:200），4oC冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次1 min，每張切片滴加50 μL的二抗 （二步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒，丹麥Dako公司），室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次1 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照為PBS代替一抗。

1.3 結果判定 以PBS代替一抗設定為陰性空白對照，同時用已知陽性標本作為陽性對照。Wnt1蛋白主要位于細胞漿中，細胞漿顯示棕色提示Wnt1陽性表達。Wnt1陽性判斷標準參考文獻[5,6]，隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞數占總細胞數的百分比，取5個視野的算術平均值。截斷值取50%，即≥50為陽性，＜50%為陰性。

1.4 統計處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析處理，Wnt1表達陽性與陰性病例的比較采用χ2檢驗，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗，影響生存期的相關因素分析采用Cox多因素回歸分析法，所有檢驗和P值均為雙側，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Wnt1蛋白在非小細胞肺癌中的表達 免疫組化的結果顯示Wnt1在NSCLC中的表達位于細胞漿中（圖1），在NSCLC和肺良性病變組織的表達的陽性率分別為62.6%、31.6%。Wnt1蛋白在NSCLC組織中的表達顯著高于對照組（χ2=4.474, P=0.034）（表2）。

2.2 Wnt1蛋白在非小細胞肺癌中的表達和臨床病理特征的關系 Wnt1蛋白在NSCLC中的表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、病理類型、淋巴結分期、pTNM分期、是否為BAC和腫瘤細胞的分化無明顯相關性（表3）。

2.3 Wnt1蛋白的表達與非小細胞肺癌預后的關系 115例NSCLC患者從手術日期開始隨訪，至患者死亡結束，未死亡的至2009年3月21日截止。用Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗，Wnt1蛋白陽性表達組與陰性表達組在生存上有統計學差異（P=0.03）（圖2）；對性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、病理類型、淋巴結轉移、是否為BAC、腫瘤細胞的分化、pTNM分期、Wnt1蛋白等12個因素進行Cox模型多因素分析，結果表明，Wnt1蛋白和腫瘤分化是影響非小細胞肺癌預后的獨立危險因素，Wnt1蛋白陽性的患者預后差（OR=1.834, P=0.032），腫瘤細胞分化越差的患者預后越差（OR=2.931, P＜0.001）（表4）。

3 討論

Wnt信號轉導通路可分為經典通路和非經典通路兩類，而目前認為經典通路調控細胞增殖和活化，與腫瘤的發生發展密切相關[7]。Wnt蛋白作用于細胞膜上的受體，信號傳入細胞后，經散亂蛋白傳至糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）、β連環蛋白、APC蛋白和軸蛋白，形成多聚蛋白復合體。GSK-3β的磷酸化作用引起β連環蛋白降解，使后者在細胞質內的游離量保持在較低水平；當GSK-3β被Wnt信號抑制后，β連環蛋白的降解隨即被中斷，使細胞內游離的β連環蛋白含量增加，并進入核內，作用于T細胞因子/淋巴樣增強因子（T cell factor/lymphocyte enhancer factor, TCF/LEF），并形成β連環蛋白-TCF/LEF轉錄復合體，最終激活Wnt信號的有關靶基因（主要為c-myc和cyclin D1），調控胚胎發育及細胞生長、分化和凋亡。

表 1 115例非小細胞肺癌病人臨床特點Tab 1 Characteristics of 115 patients with NSCLC

表 2 Wnt1蛋白在NSCLC和良性病變組織中的表達Tab 2 Expression of Wnt1 in NSCLC and benign lesion

表 3 NSCLC組織中Wnt蛋白表達與臨床病理參數特征的關系Tab 3 Relationship between the expression of Wnt1 and clinicopathological characteristics of NSCLC patients

表 4 NSCLC預后因素多變量Cox回歸分析Tab 4 Multivariate regression analysis in predicting survival of 115 patients with NSCLC

圖 1 Wnt1在非小細胞肺癌中的表達情況（DAB，×400）。A：Wnt1在鱗癌組織中的陰性表達；B：Wnt1在鱗癌組織中的陽性表達；C、D：Wnt1在腺癌中的陽性表達。Fig 1 Expression of Wnt1 in NSCLC (DAB, ×400). A: Negative expression of Wnt1 in squamous cell carcinoma； B: Positive expression of Wnt1 in squamous cell carcinoma； C, D: Positive expression of Wnt1 in adenocarcinoma.

圖 2 Wnt1蛋白的表達與115例NSCLC患者Kaplan-Meier生存分析Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of the expression of Wnt1 in 115 patients with NSCLC

已發現Wnt1與許多腫瘤有關，包括結直腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、基底細胞癌、肺癌、間皮瘤[8-10]。Wnt1蛋白在NSCLC組織中的表達目前報道較少，國內目前只有兩篇小樣本（分別為60例、63例）文獻報道[11,12]，這兩篇報道均未闡述Wnt1表達與預后的關系，國外同一所醫院的Na-kashima、Huang等[6,13]報道Wnt1蛋白在NSCLC組織中表達與預后相關，并可作為獨立的預后因素。本研究通過免疫組化的方法檢測NSCLC組織內Wnt1蛋白的表達情況及與臨床病理特征的相關性。結果顯示Wnt1蛋白在NSCLC中的陽性表達顯著高于肺良性病變組織，但與臨床病理特征無明顯的相關性。本實驗通過隨訪獲得患者的生存期，用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗提示Wnt1陽性表達的NSCLC患者預后較差，Cox模型多因素分析結果表明Wnt1蛋白是影響NSCLC預后的獨立危險因素，與Nakashima、Huang等[6,13]的研究結果一致。提示Wnt1蛋白的陽性表達可以作為判斷NSCLC預后的獨立指標之一。Nakashima、Huang等[6,13]同時通過研究得出Wnt1的表達與其下游的Ki-67、c-Myc、Cylin D1、MMP-7、VEGF-A有關，而上述因子主要與腫瘤的增殖及腫瘤新生血管形成有關，故這是Wnt1的可能作用機制。本文是國內第一篇研究Wnt1與NSCLC預后的文獻，同時本文還研究了Wnt1的表達與臨床病理特征的相關性，其結果與兩篇國外報道一致，而國內的兩篇文獻報道其陽性表達與部分臨床病理特征相關，目前國內外關于Wnt1預后的文獻報道較少，其確切的機制及與臨床病理特征的相關性有待進一步探討。

分子靶向治療的發展開創了NSCLC治療的新領域，目前已被NCCN推薦作為二線藥物及部分患者的一線藥物，尋找作用于新的靶點的藥物是近年來研究的熱點。抑制肺癌組織中Wnt信號異常表達可以誘導細胞凋亡、抑制腫瘤增殖，利用該通路中特異信號分子及其下游效應物可以實施腫瘤靶向性治療策略，通過基因選擇性殺傷惡性腫瘤細胞。目前，已發現作用于Wnt信號通路的拮抗劑有DKK（Dickkopf）家族、分泌型frizzled相關蛋白（secreted frizzled-related protein family, sFRP）、Wnt抑制因子-1（Wnt inhibitory factor-1, WIF-1）[14,15]和內皮抑素[16]。隨著對Wnt信號通路及其各成員研究的不斷深入，我們對Wnt信號通路在腫瘤發生發展中的作用將會進一步明確，預計針對Wnt信號通路不同位點的特異性靶向治療藥物將得到開發。

雖然對Wnt通路的研究取得許多突破，但仍有很多方面有待進一步研究，如對該通路中的一些未知因子的探索；進一步研究Wnt信號轉導通路中各基因及表達蛋白的互相作用，從而更深層次闡明腫瘤的發生機制；在單一細胞中Wnt信號轉導通路研究的基礎上，進一步分析與其他通路之間的相互聯系；將Wnt信號轉導通路作為抗腫瘤治療起點，研制抗腫瘤藥物應用于臨床有待深入研究。