端粒酶與CYFRA21-1聯合測定對肺癌所致惡性胸腔積液同良性胸腔積液鑒別的診斷意義

李紅梅 付軍樺 修元德 周清華

胸腔積液可由多種良惡性疾病引起，性質不同，治療方案及預后均不同。目前，常用于胸腔積液鑒別診斷的有胸水常規、生化、細胞學及癌胚抗原等方法，但其靈敏性、特異性及準確性均較低。胸膜活檢和胸腔鏡等檢查的準確性高，但創傷大、價格高。臨床上仍有20%-30%的患者在使用常規方法仍不能明確胸腔積液的性質。近年研究[1,2]表明，端粒酶和細胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）在惡性胸腔積液中呈陽性表達，可用于惡性胸腔積液的鑒別診斷。

本文采用端粒重復序列擴增-酶聯免疫吸附實驗法（TRAP-PCR-ELISA）和酶免疫分析法（EIA）分別測定了80例惡性胸腔積液和50例良性胸腔積液患者胸水中端粒酶活性和CYFRA21-1水平，探討聯合檢測此兩項腫瘤標志物在良惡性胸腔積液中的鑒別診斷價值，報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 選擇青島大學醫學院附屬醫院2007年1月-2008年12月收治的130例胸腔積液患者，其中肺癌伴胸腔積液患者80例，男50例，女30例，年齡49歲-76歲，平均年齡59.5歲。均有確切的病理組織學或細胞學診斷依據，其中鱗癌39例，腺癌21例，小細胞癌15例，大細胞癌5例。良性胸腔積液患者50例，男32例，女18例，年齡47歲-73歲，平均年齡57.5歲，患者均依據臨床表現、結核菌素試驗、胸水常規生化、細菌培養等檢查確診，其中結核性胸膜炎25例，肺炎18例，支氣管擴張5例，肺膿腫2例。

1.2 端粒酶活性測定 常規行胸腔穿刺術抽取新鮮胸水100 mL送檢，離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清，離心細胞置液氮中保存（-196oC）。檢測前用預冷的PBS緩沖液（pH7.4）漂洗細胞2次，分別離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清。加預冷的端粒酶裂解緩沖液，0oC 孵化30 min，離心（4oC, 12 000 r/min, 20 min），吸出上清液，取少許測定蛋白濃度，將細胞提取物稀釋至3 μg/μL。采用TRAP-ELISA法，將上述各種標本的沉淀細胞（約105-106）置于1.5 mL離心管，150 μL裂解液抽提端粒酶。端粒酶活性和聚合酶鏈反應（PCR）擴增反應系統：5×端粒重復擴增反應混合液，10 μL；TaqDNA多聚酶（5 U/μL），0.4 μL；再加2 μL樣品提取液；37.6 μL蒸餾水。采用PCR擴增儀，酶反應：30oC、30 min。PCR循環擴增：94oC、30 s，55oC、30 s，35個循環。陰性對照加2 μL裂解液；陽性對照加1 μL端粒酶質控模板溶液。擴增產物經包被好的微量96孔板捕獲后，加人辣根過氧化物酶標記的抗二硝基苯抗體（Anti-DNP）孵育1 h后洗滌，四甲基聯苯胺（TMB）顯色10 min。MK3酶標儀（Dragon Lab System公司）上用雙波長法測定各孔波長450 nm吸光度（A450）、波長690 nm吸光度（A690）的值，A690為參考波長，用于消除孔間誤差。端粒酶活性為△A=A450-A690。△A大于陰性對照孔的2.0倍即判定為端粒酶陽性。敏感性=惡性胸水患者中陽性例數/惡性胸水患者總數；特異性=良性胸水患者中陰性例數/良性胸水患者總數；準確性=（惡性胸水患者中陽性例數+良性胸水患者中陰性例數）/患者總數。

1.3 CYFRA21-1測定 取胸腔積液5 mL采用酶免疫分析法（EIA）測定CYFRA21-1。試劑盒由德國Boehringer Mannheim公司提供。陽性判斷標準為 CYFRA21-1＞10 ng/mL，嚴格按試劑盒說明書要求操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析，計算敏感性、特異性和準確性，進行綜合評價。計量資料以Mean±SD表示，樣本均數采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平檢測結果 在80例肺癌致惡性胸腔積液中，有35例發現了惡性腫瘤細胞，端粒酶活性為0.395±0.157，其余45例未找到惡性腫瘤細胞，端粒酶活性為0.347±0.108。良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平檢測結果見表1，惡性胸腔積液組端粒酶活性和CYFRA21-1水平均明顯高于良性胸腔積液組，差異有統計學意義（P＜0.001）。

表 1 良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平的表達（Mean±SD）Tab 1 The expression of telomerase activity and CYFRA21-1 level in benign and malignant pleural effusion (Mean±SD)

2.2 端粒酶和CYFRA21-1單項及聯合檢測對惡性胸腔積液的診斷價值 由表2可見，兩項腫瘤標記物聯合檢測若以一項陽性作為惡性胸腔積液的診斷標準，則聯合檢測敏感性為90.0%，明顯高于端粒酶和CYFRA21-1單項檢測的敏感性71.3%和60.0%（χ2=9.002和χ2=19.201，P＜0.01和P＜0.001），特異性雖下降為76%，但準確性升高為86.9%，準確性差異亦有統計學意義（χ2=4.389和χ2=14.647，P＜0.05和P＜0.001）。

3 討論

表 2 端粒酶和CYFRA21-1檢測對惡性胸腔積液的診斷價值Tab 2 The diagnotic value of telomerase and CYFRA21-1 in malignant pleural effusion

端粒是真核生物染色體末端包含著獨特重復片段的特殊結構，它能催化染色體末端的特殊結構端粒復制，它存在于人的生殖細胞、永生化細胞系、腫瘤細胞和增殖組織。惡性腫瘤細胞的一個重要生物學特征是永生化，這與端粒酶激活有關。且端粒酶活性的表達與腫瘤的發生、發展都有相關性[3,4]。研究[5]表明，大多數腫瘤組織細胞均有較高水平的端粒酶表達，而在正常組織和體細胞為陰性，因此可作為癌癥篩選的標記物。腫瘤的胸膜轉移和胸膜原發腫瘤等引起的胸腔積液與炎性胸腔積液，其端粒酶活性的差異可用于鑒別良惡性胸腔積液。文獻[6]報道肺癌組織中端粒酶陽性率達80%，惡性胸液中端粒酶陽性率約為47.5%-91.4%。

CYFRA21-l是細胞角蛋白19片段，由多種上皮細胞表達，是一種分子量為40 ku-68 ku的細胞結構蛋白，主要分布于肺組織尤其是肺腫瘤上皮細胞漿中，可在激活的蛋白酶作用下被降解或在細胞死亡后以溶解片段形式釋放入血清中[7]。研究[8]表明：惡性胸腔積液患者血和胸水中CYFRA21-1水平均明顯增高，且以胸水中升高明顯，其對惡性胸腔積液診斷敏感性約50%-77%，特異性約60%-79%。

本研究選擇80例惡性胸腔積液患者和50例良性胸腔積液患者，分別檢測其胸水中端粒酶活性和CYFRA21-1水平，結果發現惡性胸腔積液患者端粒酶活性明顯高于良性胸腔積液患者，CYFRA21-1水平亦明顯高于良性胸腔積液患者，與相關文獻報道一致[9,10]。故端粒酶和CYFRA21-1均可作為良惡性胸腔積液鑒別診斷的輔助手段。

由于腫瘤細胞具有異質性，迄今為止尚未發現對各型癌癥均具有高度特異性和敏感性的標志。眾多研究者已達成共識，通過采用聯合檢測可提高診斷效能，彌補單項標志對不同組織類型腫瘤敏感性不同的缺點。本實驗結果也顯示，端粒酶和CYFRA21-1兩項腫瘤標志聯合測定若以一項陽性作為惡性胸腔積液的診斷標準，則敏感性為90.0%（72/80），特異性為76.0%（38/50），準確性為86.9%（113/130）；若以兩項均陽性作為診斷標準，敏感性下降至56.3%（45/80），特異性可達94.0%（47/50），準確性下降至70.8%（92/130）。因此，臨床如有一項陽性，要考慮惡性胸腔積液的診斷，并作進一步檢查；如兩項同時陽性則診斷為惡性胸腔積液的特異性高。上述結果表明聯合測定胸腔積液中端粒酶和CYFRA21-1水平，可提高惡性胸腔積液的診斷率，尤其對良性和惡性胸腔積液的鑒別診斷具有重要的意義。