土牛膝中齊墩果酸、牛膝多糖的提取與鑒定

黃志芳 黃志紅 胡吉林 周躍輝 魏得良

土牛膝，別名倒扣草，《中國(guó)藥典匯編》對(duì)土牛膝有如下記載:藥性:苦、涼。歸肺、脾、肝、膀胱經(jīng)。藥效:敗毒抗癌、逐淤除痹，消炎利尿。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，土牛膝具有改善機(jī)體微循環(huán)，調(diào)整新陳代謝，改善免疫功能等作用。具有明顯的抗炎抗菌作用、鎮(zhèn)痛作用、抗衰老等［1-3］作用。近年來有研究表明與牛膝含有成分的齊墩果酸、牛膝多糖具有治療糖尿病的功效［4-6］，但土牛膝提取物在治療糖尿病方面的研究尚無報(bào)道。以本地野生土牛膝為原料經(jīng)過提取、分離、過濾、干燥得到土牛膝提取物齊墩果酸、牛膝多糖，將對(duì)土牛膝提取物治療糖尿病的研究具有重要意義。

1 材料

1.1 土牛膝 湖南郴州郊外野生自己采集、洗凈、除去殘留蘆頭、切段、曬干。

1.2 試劑和儀器 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級(jí)純，什邡市巨邦植物原料有限公司;葡萄糖，其余試劑均為市售分析純。電子天平，上海精密儀器儀表有限公司;低壓型抽慮裝置，唐山市玻璃儀器廠;722型分光光度計(jì)，上海天翔光學(xué)儀器有限公司;硅膠板:5～12 cm北京市昌平石鷹化工廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 土牛膝中齊墩果酸的提取［7］

2.1.1 土牛膝水煮提取液 取土牛膝150 g，制成細(xì)塊狀藥材，105℃烘干3 h，取出加10 g碳酸鈣細(xì)粉和6倍量的蒸餾水，置于1000 ml大燒杯中加熱煮沸3次:每次煮沸2 h后過濾得到濾液和濾渣，濾液貯存待用，濾渣用同法煮沸3次，將3次濾液合并，放置5 h后析出沉淀，取上層清液約200 ml。

2.1.2 齊墩果酸的粗提 將上清液置于500 m l燒杯中，加5%Hcl 50 m l混勻，60℃左右水浴加熱水解約5 h，水解完畢后溶液有褐色沉淀產(chǎn)生，趁熱過濾，水洗濾餅后，濾餅用3%NaOH溶液煮沸后即時(shí)過濾得到濾餅，濾餅用水煮沸一次，沸騰后即時(shí)過濾，得到鈉鹽粗品。

2.1.3 齊墩果酸的精制 將粗品加1%活性炭和10倍量的95%乙醇回流熱熔1 h趁熱過濾，濾液放冷后以稀HCL調(diào)PH在1到2之間，放置24 h，使結(jié)晶充分，抽濾干后，以蒸餾水洗至近中性，60℃烘干，得齊墩果酸精品1.32 g。

2.1.4 齊墩果酸提取率 提取率=1.32 g/150 g×﹪=0.88%。

2.1.5 齊墩果酸提取品的鑒定［8］性狀:呈白色針狀結(jié)晶與標(biāo)準(zhǔn)品相同。Liebermann-burchard反應(yīng):兩液面交界處出現(xiàn)紅紫色環(huán)，為陽性反應(yīng)。薄層層析及顯色:如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸斑點(diǎn)顯紫紅色微泛藍(lán)黑色，測(cè)定RF值為9.5 cm。供試品在標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸出現(xiàn)斑點(diǎn)的平行位置處出現(xiàn)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)顯紫紅色微泛藍(lán)黑色，測(cè)定RF值為9.4 cm，約為9.5 cm，可以確認(rèn)供試品的主要成分一樣都是齊墩果酸。

2.2 土牛膝中齊墩果酸的含量測(cè)定［9］

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取土牛膝的粗粉0.8 g，加50%乙醇-濃硫酸9:1試液20 ml于85℃水浴中回流提取2 h過濾，洗滌，合并濾液，置水浴上揮發(fā)去溶劑，殘留物用甲醇溶解，置過濾，然后定容10 m l，即得供試品液。

圖1 齊墩果酸的薄層色譜圖

圖2 牛膝多糖水解產(chǎn)物和果糖的TLC圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品25.52 mg，置于25 m l量瓶中，用氯仿稀釋至刻度。取此對(duì)照品溶液10、20、30、40、50 μl于試管中，加 5% 香草醛-冰醋酸溶液 0.20 m l，高氯酸0.8 ml于60℃水浴上加熱10 min。取出，立即用冷水冷卻，然后加冰醋酸5.00 ml稀釋，搖勻后于722型分光光度計(jì)550nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸收度A。由吸收度和相應(yīng)齊墩果酸對(duì)照品量求得回歸方程為∶A=0.0072B-0.0068，r=1。

2.2.3 含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液0.05 ml，用對(duì)照品相同的方法測(cè)得吸收度A=0.2233，通過計(jì)算得齊墩果酸的含量為0.799%。

2.3 土牛膝中牛膝多糖的提取［10］

2.3.1 乙醇回流提取 土牛膝粗粉50 g，用75%乙醇回流提取，回收乙醇，得到藥渣，干燥后水提，再濃縮水提液，加95%乙醇充分沉淀，過濾后將沉淀再次水溶解，加入三氯乙酸去除蛋白，取上清液。上清液加95%乙醇沉淀，得到的沉淀物經(jīng)過抽濾后并經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚相繼洗滌后低溫干燥得牛膝多糖產(chǎn)品3.6 g。牛膝多糖的提取率為:3.6 g/50 g=7.2%。

2.3.2 牛膝多糖提取品的鑒定 性狀:呈紅褐色粉末狀。牛膝多糖水解后會(huì)得到葡萄糖和果糖，并且葡萄糖:果糖=1:8。只要鑒定土牛膝多糖的水解產(chǎn)物中含有葡萄糖和果糖，就可證明樣品是土牛膝多糖。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄V B)試驗(yàn)，薄層層析及顯色:如圖2所示，果糖標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖上的主斑點(diǎn)與提取物水解產(chǎn)物的薄層色譜圖上的主斑點(diǎn)在相同位置上出現(xiàn)，其RF值相同。斑點(diǎn)的顏色深淺一致，說明該提取物水解產(chǎn)物中含有果糖。做斐林反應(yīng)有磚紅色沉淀產(chǎn)生，說明該提取物水解產(chǎn)物中含有葡萄糖。由此可以證明本實(shí)驗(yàn)的提取品是牛膝多糖。

2.4 土牛膝中多糖的含量測(cè)定［11］:

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取土牛膝細(xì)粉1.000 g。加95%乙醇100 m l，60℃回流提取3 h后過濾醇提藥液得到藥渣，將藥渣干燥 。藥渣加水50 ml回流提取2 h，過濾得到濾液，提取3次，合并3次濾液約80 ml用500 ml潔凈燒杯貯存。然后濃縮至25 ml，加95%乙醇至含醇量85%，放置24 h使其充分沉淀，抽濾溶液得到殘?jiān)瑲堅(jiān)?5%乙醇洗滌，殘?jiān)匀桓稍铮?00 m l容量瓶定容。精密吸取1 ml置50 ml量瓶中定容，即得供試品溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葡萄糖0.002 g，置50 m l容量瓶中 ，用水溶解定容，即得葡萄糖對(duì)照品溶液45 μg/ml。精密吸取對(duì)照品溶液0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml于刻度試管中，加蒸餾水至2.0 m l，加5%苯酚溶液1 ml，混勻，迅速加入5 m l濃硫酸，振搖5 min，置沸水浴中15 min，再置冷水浴中冷卻30 min，在分光光度計(jì)上485 nm處測(cè)定吸收度。得回歸方程:A=0.01B-0.0608，R=1。

2.4.3 含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液25 μl，用對(duì)照品相同的方法測(cè)得吸收度A=0.2605，通過計(jì)算得齊墩果酸的含量為12.85%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用水煮法提取齊墩果酸提取率為0.88%。分光光度計(jì)法測(cè)定土牛膝中齊墩果酸的含量為0.799%。提取率比含量略大(0.88% ＞0.799%)，說明提取品齊墩果酸中還是有少量的雜質(zhì)。用醇提法得到土牛膝多糖的提取率為7.2%，分光光度法測(cè)定土牛膝中牛膝多糖的含量為12.85%，提取率比含量略小(7.2% ＜12.85%)，說明提取牛膝多糖不夠完全。

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