神經組織特異表達 CTF1轉基因小鼠的建立

呂 丹,陳 煒,曹興水,張曉娟,王書美,張連峰

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

研究報告

神經組織特異表達 CTF1轉基因小鼠的建立

呂 丹,陳 煒,曹興水,張曉娟,王書美,張連峰

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

目的建立神經組織特異表達 CTF1的轉基因模型小鼠,為研究 CTF1生物學功能及與老年癡呆等疾病發病機制的關系提供工具動物。方法把 CTF1基因插入神經組織特異的啟動子 PDGF下游,構建轉基因表達載體,顯微注射法建立 C57BL/6J CTF1轉基因小鼠。PCR鑒定轉基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鑒定CTF1在腦組織中的表達,對轉基因小鼠腦組織進行石蠟切片,HE染色,顯微鏡觀察組織結構形態的改變。結果建立了 2個不同表達水平的 CTF1轉基因小鼠品系。轉入的 CTF1基因在腦組織的表達水平均高于同齡對照小鼠。組織學分析顯示 CTF1轉基因小鼠大小腦組織基本結構形態未見異常。結論成功建立了穩定遺傳的神經組織特異表達CTF1轉基因小鼠品系,為 CTF1的生物學功能及與老年癡呆等疾病發病機制關系的研究提供了有力的模型工具。

心肌營養素-1;神經組織;轉基因

1995年 Pennica等[1]從小鼠心臟分離的胚胎干 細胞中克隆出一種細胞因子 -心肌營養素-1(Cardiotrophin 1,CTF1)。序列同源性比較及結構分析表明,CTF1屬于白細胞介素-6(Interleukin-6, I

L-6)細胞因子家族。CTF1存在于多種組織中,是一種具有廣譜生物學活性的細胞因子,具有心肌肥大及心肌細胞保護作用,同時其作為一種多效性細胞因子對包括神經系統在內的其他組織皆產生廣泛的生物學影響。

人 CTF1基因位于染色體 16p11.1～p11.2[2]。人 CTF1 mRNA長 1539 bp,編碼 201個氨基酸組成的蛋白質,相對分子質量為 26 700,全長 CTF1蛋白沒有N端分泌信號肽的疏水性序列及糖基化位點,只有小鼠 CTF1含有一個N端潛在糖基化位點。人和大鼠 CTF1氨基酸序列的同源性為 81%,人與小鼠為 79%。根據蛋白質結構分析[1,2],CTF1屬于白細胞介素-6( IL-6)/白細胞介素-11( IL-11)/睫狀神經營養因子 (Ciliary neurotrophic factor,CNTF)/抑瘤素 M(Oncostatin,OS M)/白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,L IF)細胞因子家族,該家族成員在氨基酸Ⅰ級結構上有較低的同源性,但它們在Ⅲ級結構上都具有 4個α螺旋組成的螺旋束,同時該家族都通過 gpl30同源二聚體或 gpl30/ L IF受體β(L IF receptorβ,L IFRβ)異源二聚體的形成進行信號傳遞,有類似的生物學活性。CTF1作為I

L-6細胞因子超家族的一員,它們以糖蛋白鏈細胞因子受體亞單位 gpl30作為共同的受體和轉導子, CTF1的第二個受體:白血病抑制因子受體亞單位β (L IFRβ),即 gpl90。此外,CTF1還有第三個受體,是相對分子質量 80×103的 CTF1特異受體,類似于CNTF受體成分中的α亞基,其可能與 gpl30和gpl90形成三聚體[3]。CTF1和特異的受體結合后,誘導 gpl30同源二聚體或異源二聚體的形成,從而激活與之結合的胞漿內的酪氨酸激酶,激活 Janus激酶(JAKs)和 gpl30酪氨酸激酶磷酸化,導致多個信號通路的激活[4]。目前已發現 CT-1細胞內信號通路包括 JAK/STAT3,MAPK/ERK和 PI3-K/Akt,其下游介質有多聚 ERK配對轉錄因子、核因子-3、STAT3和熱休克蛋白 (HSP)56、70、90等[5]。

作為一種多效性細胞因子,CTF1在神經系統具有類似于其它神經營養因子的生物學作用。CTF1能維持運動神經元、多巴胺神經元和交感神經元長時間存活,誘導培養交感神經元遞質表型的連接[6-8]。而 CNTF僅能保護交感神經元,并不能誘導產生對多巴胺能神經存活的生物學效應,因此CTF1較 IL-6家族其他成員具有更強的神經系統作用。除了對不同神經元的保護效應外,CTF1還能夠誘導體外培養的交感神經元的顯性轉換。這將導致其轉化為產生膽堿乙酰基轉移酶及血管活性肽的膽堿能顯性,同時伴有類似于酪氨酸過氧化物酶的兒茶酚胺酶的遺失[9]。此外,大腦發育過程中星形細胞的分化是通過 CTF1誘導的信號與骨形成蛋白之間的互作來實現的[10]。

鑒于 CTF1在神經系統上的研究日益增多,其對神經系統的影響及其與神經系統相關疾病的關系逐漸被人們所重視。本研究經 CTF1基因插入PDGF B-鏈啟動子下游,通過轉基因技術將 CTF1基因轉入 C57BL/6J小鼠,建立了神經組織特異表達CTF1的轉基因小鼠,并對轉基因小鼠的腦組織進行組織學觀察分析,為 CTF1在神經系統的生物學功能研究,以及 CTF1對老年癡呆及帕金森等神經系統疾病發病機制的研究提供有價值的模型動物。

1 材料和方法

1.1 CTF1表達載體的構建及轉基因

以 pCMV-SPORT6-CTF1質 粒 (Openbiosy ster ms,Clone ID5750481,美國)為模板,通過 PCR擴增獲得帶有 HindⅢ和 XholⅠ酶切位點的完整的CTF1基 因 (BC064416),上 游 引 物 為:5′-TATAAGCTTCACCATGAGCCGGAGGGAG-3′;下游引物為:5′-AAACTCGAGCAAAGAAGCGGAAGGAGAG ACG-3′(上海生物工程技術有限公司合成,中國)。將 CTF1片段插入 pMD18T載體,經測序并比對正確無突變堿基后,以 HindⅢ和 XholⅠ(寶生物工程有限公司,中國)酶切回收該片段,并克隆入 PDGF B-鏈啟動子(TuckerCollins博士惠贈,哈佛大學醫學院)的下游構建神經組織特異表達 CTF1表達載體。提取并酶切鑒定質粒正確后,再用 Tth111Ⅰ和 XbaⅠ (寶生物工程有限公司,中國)將其線性化, Sephedex G50柱純化DNA片段,獲得 PDGF啟動的CTF1基因的轉基因片段,注射前將其濃度調整至 5 ng/μL,用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所,康藍公司。XCXK(京) 2004001],用 I CR小鼠作假孕受體 (本實驗室飼養),制備轉基因小鼠 (TE2000U顯微注射儀)[11]。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準,批準號為 GC05004。

1.2 PCR鑒定 CTF1轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標記,收集剪下的組織,用堿裂解法提取基因組 DNA[12],用PCR法對轉基因小鼠進行基因型檢測。PCR上游引物為:5′-AGCCGGAGGGAGGGAAGTCT-3′,下游引物為:5′-AGAAGCTGGGCAGCCCGAAG-3′(上海生物工程技術有限公司合成,中國)。PCR反應體系20μL(寶生物工程有限公司,中國)。反應條件: 94℃預變性 3 min,94℃變性 30 s,65℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s,重復變性到延伸 29次,完成 30個循環。目的基因 CTF1片段為 181 bp。

1.3 W estern Blot鑒定 CTF1的表達

分別提取 2只首建鼠的 F1代陽性轉基因小鼠和同齡陰性對照小鼠腦組織總蛋白,進行 SDSPAGE凝膠電泳,蛋白轉移至NC膜上(Millopore,美國),置于 5%脫脂奶粉封閉液,羊抗 CTF1抗體檢測 CTF1蛋白的表達水平 (Abcam,美國),辣根過氧化物酶 (HRP)-偶聯的兔抗羊抗體結合一抗 (Pierce,美國),HRP-偶聯的鼠抗β-actin單克隆抗體作為內參(康成生物,中國)。

1.4 組織學觀察 CTF1轉基因小鼠腦組織

選用 1月齡和 4月齡轉基因和同齡陰性對照小鼠,頸椎脫臼法犧牲小鼠,打開顱腔取出完整腦組織,中性福爾馬林溶液中固定 24 h,脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察(Nikon顯微鏡,日本)組織學變化。

2 結果

2.1 CTF1表達載體的構建

用 PCR法克隆的 CTF1基因,測序結果表明克隆的 CTF1基因與已報道 CTF1序列完全一致(GenBank:BC064416.1),將該基因插入神經組織特異表達的 PDGF啟動子的下游,構建CTF1轉基因表達載體 (圖 1)。

2.2 CTF1轉基因小鼠的基因型

用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,轉入到假孕受體 I CR小鼠中,小鼠出生 9～14 d提取基因組DNA,用 PCR擴增CTF1目的基因 181 bp的片段來鑒定CTF1轉基因小鼠基因型(圖 2),共得到 2只首建鼠,均可傳代。

2.3 CTF1基因的表達

分別提取 2個首建鼠的 F1代轉基因小鼠和同齡陰性對照小鼠腦組織總蛋白,用 CTF1多克隆抗體進行Western Blot分析,結果顯示在相對分子量為 21×103處,6號和 12號轉基因陽性小鼠品系腦組織內 CTF1蛋白表達量明顯高于同齡陰性對照小鼠(圖 3見彩插 4)。

圖 1 CTF1轉基因表達載體Fig.1 CTF1 transgenic construct

圖 2 PCR分析 CTF1轉基因小鼠基因型Fig.2 Genotyping CTF1 transgenic mice by PCR注:M:DNA分子量標記;1:陽性對照;2:陰性對照;3:空白對照;6,7,9:F1代陽性轉基因小鼠;4,5,8:F1代陰性轉基因小鼠

2.4 CTF1轉基因小鼠腦組織學改變

將 1月齡和 4月齡的 CTF1轉基因小鼠和同齡陰性小鼠的腦組織進行解剖和組織結構形態觀察,未發現異常。將腦組織進行 H&E染色,鏡下觀察, CTF1轉基因小鼠與同齡陰性對照小鼠相比較,大腦皮質,深層髓質,軟膜,神經膠質細胞及錐體細胞等均未見明顯結構形態的改變。小腦分子層、蒲肯野細胞層及顆粒層亦未見明顯結構形態的改變 (圖 4見彩插 4)。

3 討論

CTF1屬于 IL-6細胞因子家族,存在于多種組織中,由于 IL-6細胞因子家族成員在生物學作用上具有多樣性和重疊性的特點,決定了 CTF1對多個系統具有廣泛的影響,是一種具有廣譜生物學活性的細胞因子,CTF1不僅對心臟產生多種影響[13],在神經系統還具有類似于其它神經營養因子的生物學作用。CTF1能維持運動神經元,多巴胺神經元和交感神經元長時間存活,誘導培養交感神經元遞質[7,8,14],然而 CTF1的神經元保護維持作用的具體機制尚不明確[15]。CTF1是為研究心肌肥大作用而克隆出的細胞因子,隨后的研究使人們更感興趣的是 CTF1的心肌保護和神經元保護作用。目前有關CTF1基因結構、受體組成及 CTF1對不同組織細胞的生物學作用的研究已經相繼展開。

本文建立的神經組織特異表達 CTF1轉基因小鼠,腦組織中 CTF1蛋白表達明顯高于對照小鼠,轉基因小鼠大、小腦組織結構形態未見明顯改變。未來將本文建立的神經組織特異表達 CTF1轉基因小鼠與基因突變致早老癡呆轉基因小鼠模型雜交,對子代雙轉基因小鼠模型腦組織病理學改變及相關機制的研究,有望進一步加深 CTF1對神經系統,如在神經元保護及在神經遞質的傳遞等方面的作用機制的理解,同時對臨床上包括老年癡呆,帕金森等神經退行性疾病發病機制及治療方面的深入研究皆具有重要意義。

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The Establishment of CTF1 Gene TransgenicM ice Specifically Expressed in Nervous Tissues

LV Dan,CHENGWei,CAO Xing-shui,ZHANG Xiao-juan,WANG Shu-mei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Disease ComparativeMedicine,Ministry of Heath, Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences& ComparativeMedical Center,PekingUnionMedical College,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo generate the CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues and to make an animalmodel for the study of its function and effects on Alzheimer’s disease。MethodsTransgenic mice were created by the methods of microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR.The brain specific expression of the CTF1 gene was analyzed byWestern Blot.The histological changes of the brain from the transgenic mice were analyzed by microscope observation。ResultsTwo transgenic lines with high level of expression of the CTF1 gene were selected from three transgenic lines.The transgenic mice show no difference compared with wild type by histological detection on brain tissues。Conclusions A CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues was established,itwill be an useful animalmodel to study the CTF1 functions on AD.

CTF1;Nervous tissues;Transgene

R349.83

A

1671-7856(2010)01-0028-04

2009-09-09

衛生部行業基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

呂丹(1980年 -),女,實習研究員。E-mail:lvdan0707@163.com

張連峰。E-mail:Zhanglf@cnilas.org