四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病模型效果的性別差異

葉華虎,袁菊芳,李 敏,王艷靜,董 罡,楊麗萍,張廣州,張小飛,曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071)

研究報(bào)告

四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病模型效果的性別差異

葉華虎,袁菊芳,李 敏,王艷靜,董 罡,楊麗萍,張廣州,張小飛,曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071)

目的了解性別因素對(duì)四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型的影響,為提高動(dòng)物模型的復(fù)制效率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法分別給雌、雄比格犬和昆明小鼠注射不同劑量的四氧嘧啶,藥后 3、7、14、21 d測(cè)定血糖值,同時(shí)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的死亡情況。結(jié)果給予同等劑量的四氧嘧啶,雌性比雄性動(dòng)物的血糖升高更快,濃度更高。雌性犬四氧嘧啶的最適造模劑量為 40 mg/kg,而雄性犬在此劑量下的模型成功率只有 40%,二者差異極顯著 (70%VS 40%,P<0.01);雄性犬的最適使用劑量為 50 mg/kg,但在此劑量下有高達(dá) 30%的雌性犬因高血糖而死亡。四氧嘧啶對(duì)小鼠的影響與犬基本一致,雌雄鼠的最佳劑量分別為200 mg/kg和250 mg/kg。結(jié)論雌性動(dòng)物對(duì)四氧嘧啶的敏感性較雄性動(dòng)物高,雄性動(dòng)物在使用四氧嘧啶復(fù)制糖尿病模型時(shí),其劑量通常需要較雌性動(dòng)物高 20%左右。

四氧嘧啶;糖尿病;模型,動(dòng)物;血糖

四氧嘧啶是制備糖尿病動(dòng)物模型的常用藥物,其機(jī)制是選擇性地破壞胰島β細(xì)胞,引起細(xì)胞死亡,導(dǎo)致血中胰島素濃度下降及高血糖產(chǎn)生,形成胰島素依賴性糖尿病。利用四氧嘧啶制備糖尿病動(dòng)物模型,已有大量文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)于成模的影響因素 (如飼料成分、給藥次數(shù)、給藥途徑、動(dòng)物體重等)也較為清楚[1-6]。本研究通過(guò)四氧嘧啶藥物誘發(fā)不同性別動(dòng)物制備糖尿病動(dòng)物模型的量效關(guān)系,闡明四氧嘧啶藥物效應(yīng)的性別差異,為提高誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型效率提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:比格犬 80只,10～12 kg,雌雄各半;昆明小鼠 120只,18～22 g,雌雄各半。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[I CXK-(軍)2007-004]。

1.1.2 試劑:四氧嘧啶 (alloxan),美國(guó) sigma公司產(chǎn)品,臨用前用生理鹽水配成相應(yīng)濃度。

1.1.3 儀器:One-touch穩(wěn)豪型血糖儀和血糖試紙,美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與糖尿病模型制備:比格犬分為 8組(雌雄各 4組),每組 10只,分別靜脈注射四氧嘧啶 30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg和 60 mg/kg;小鼠8組 (雌雄各 4組),每組 15只,分別腹腔注射四氧嘧啶 150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg和 300 mg/ kg。四氧嘧啶在臨用前用生理鹽水配成 1%的濃度,在注射四氧嘧啶前,動(dòng)物禁食 12 h。

1.2.2 血糖值測(cè)定:各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在給藥前及藥后3、7、14、21 d,分別測(cè)試空腹血糖值,以第 14天的血糖值≥14.5 mmol/L為模型制備成功,同時(shí)統(tǒng)計(jì) 21 d內(nèi)各組動(dòng)物的死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 雌雄比格犬注射不同劑量四氧嘧啶后的血糖濃度變化

犬注射四氧嘧啶后其血糖值變化見圖 1。雌性犬前 3 d為快速上升期,3～7 d為緩慢增長(zhǎng)期,7 d達(dá)到峰濃度,此后一直在高濃度水平微幅波動(dòng) (圖1-A),而雄性犬的血糖值增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)較雌性犬滯后,前 7 d處于快速上升期,峰濃度出現(xiàn)在藥后 14 d,較雌性犬推遲約一周(圖 1-B)。當(dāng)使用相同劑量的四氧嘧啶時(shí),雌性犬的血糖值峰濃度明顯高于雄性犬(P<0.01)。

圖 1 雌雄比格犬注射不同劑量四氧嘧啶后的血糖濃度變化(A為雌性犬,B為雄性犬)Fig.1 Changes of blood glucose concentration in female and male beagle dogs after injected different dose of alloxan (A:female dogs,B:male dogs)

2.2 雌雄比格犬注射不同劑量四氧嘧啶后的模型復(fù)制效果

雌性犬注射 40 mg/kg四氧嘧啶,70%(7/10)個(gè)體血糖值達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn) (≥14.5 mmol/L),當(dāng)劑量提高到 50 mg/kg時(shí),成模率增加不顯著(70%VS80%,P<0.05),而死亡率由 10%上升到30%。雄性犬造模的最適劑量為 50 mg/kg,血糖值達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物占 70%,低于此劑量,成模率偏低 (30 mg/kg、40 mg/kg的成模率分別為 0和20%,),高于此劑量,導(dǎo)致犬死亡增加 (60 mg/kg的死亡率為 20%,且死亡犬血糖值通常在 30 mmol/L以上)(表 1)。

表 1 雌雄比格犬注射不同劑量四氧嘧啶后的模型復(fù)制效果Tab.1 Results of diabetic animalmodel induced by alloxan in male and female dogs

2.3 雌雄小鼠注射不同劑量四氧嘧啶后的成模效果

小鼠注射四氧嘧啶后,血糖濃度變化趨勢(shì)與犬基本相似,雄性小鼠不僅表現(xiàn)血糖值增長(zhǎng)滯后,而且其濃度明顯低于雌性小鼠(圖 2)。就模型復(fù)制效果而言,雌性小鼠的最適劑量為 200 mg/kg,此時(shí)有80%的動(dòng)物血糖值達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn),死亡率也較低(6.7%),增加四氧嘧啶劑量為 250 mg/kg時(shí),雖然血糖值進(jìn)一步升高 (由 16.8 mmol/L～20.7 mmol/L升高到 25.8 mmol/L～29.2mmol/L),但模型復(fù)制效率增加不顯著 (80%VS86.7%,P>0.05),且有40%的動(dòng)物先后死亡 (死亡動(dòng)物的血糖值高于 25 mmol/L)。雄性小鼠的造模劑量以 250 mg/kg最為有利,模型復(fù)制效率為 80%,死亡率為 6.7%,與雌性小鼠的 200 mg/kg劑量組結(jié)果相似,進(jìn)一步提高四氧嘧啶注射劑量,死亡動(dòng)物明顯增加(圖 2和表 2)。

圖 2 雌雄小鼠注射不同劑量四氧嘧啶后的血糖濃度變化(A為雌性鼠,B為雄性鼠)Fig.2 Changes of blood glucose concentration in female and male mice after injected different doses of alloxan (A:female mice,B:male mice)

表 2 雌雄小鼠注射不同劑量四氧嘧啶后的模型復(fù)制效果Tab.2 Results of diabetic animalmodel induced by alloxan in male and female mice

3 討論

四氧嘧啶是胰島β細(xì)胞毒劑,通過(guò)產(chǎn)生超氧自由基而破壞β細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)DNA損傷,并激活多聚ADP核糖體合成酶活性,從而使輔酶Ⅰ含量下降,導(dǎo)致mRNA功能受損,β細(xì)胞合成前胰島素減少及胰島素缺乏[4]。四氧嘧啶糖尿病模型是目前最常用的Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型之一,模型血糖水平穩(wěn)定且維持時(shí)間長(zhǎng),有明顯的糖尿病癥狀,且模型復(fù)制時(shí)間短,操作簡(jiǎn)單,成本較低,是評(píng)價(jià)糖尿病藥物療效及安全性的常用制模方法[1-6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四氧嘧啶在雌雄動(dòng)物中的時(shí)-效和量-效關(guān)系明顯不同。雌性動(dòng)物在四氧嘧啶注射 7 d后,血糖值即可達(dá)到峰濃度,而雄性動(dòng)物較雌性動(dòng)物延遲一周,需要 14 d才能達(dá)到峰濃度。提示在以四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型以及對(duì)模型的利用時(shí),為了保持血糖值的穩(wěn)定性和一致性,提前給雄性動(dòng)物施與四氧嘧啶不失為一種值得考慮的有效方法。此外,就量-效關(guān)系而言,四氧嘧啶在不同性別中的表現(xiàn)也不相同,雌性比格犬靜脈注射四氧嘧啶40 mg/kg后,雌性組平均血糖值為 17.6 mmol/L,成模率 (即血糖值≥14.5 mmol/L)和死亡率分別為70%和 10%,而雄性組平均血糖值僅為 11.1 mmol/ L,成模率僅為 40%。當(dāng)劑量為 50 mg/kg時(shí),雌性組平均血糖值升高到 26.9 mmol/L,成模率提高到80%,但 3只高血糖動(dòng)物死亡;雄性組平均血糖值為17.1 mmol/L,成模率升高到 70%,且無(wú)動(dòng)物死亡。進(jìn)一步提高四氧嘧啶的使用劑量,雌雄犬的成模率未見明顯升高,反而都出現(xiàn)較高的死亡率。基于動(dòng)物的血糖值水平、制模成功率和死亡率等指標(biāo),我們認(rèn)為雌雄犬的使用劑量分別以 40 mg/kg和 50 mg/ kg最好。小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與犬類似,給雌鼠腹腔注射四氧嘧啶 200 mg/kg,血糖值濃度、成模率和死亡率分別為 19.0 mmol/L、80%和 6.7%,效果優(yōu)于其他劑量組;雄鼠的注射劑量需要提高到 250 mg/kg,才能獲得類似雌鼠的較好造模效果。

本實(shí)驗(yàn)在兩種動(dòng)物上的結(jié)果顯示,雄性動(dòng)物對(duì)四氧嘧啶敏感性較雌性動(dòng)物低,雄性動(dòng)物要達(dá)到與雌性動(dòng)物相近的造模效果 (成模率、相近的血糖值濃度和存活率等),四氧嘧啶的使用劑量通常較雌性動(dòng)物高 20%左右。與王曉琳等[7]的結(jié)果完全相反,作者發(fā)現(xiàn)雄性 W istar大鼠對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的敏感性明顯高于雌性鼠。雖然 STZ和四氧嘧啶二者都是破壞胰島β細(xì)胞,但二者的結(jié)構(gòu)不同,因而出現(xiàn)差異的原因推測(cè)可能與藥物的作用途徑有關(guān)。

此外,日本學(xué)者門脅孝等[8]報(bào)道,雌性 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率明顯高于雄性,但如果將雌性NOD小鼠的卵巢摘除,其發(fā)病率則降低到與雄性相同水平,相反雄性NOD小鼠摘除睪丸后發(fā)病率升高到與雌性相似,因此作者認(rèn)為雌激素可能促進(jìn)NOD小鼠的糖尿病發(fā)病,雄激素則抑制發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的性別差異是否也與雌激素和雄激素有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

[1] 楊明華,柴可夫,楊蘇蓓.四氧嘧啶致糖尿病大鼠模型血糖穩(wěn)定性考察[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2006,18(6):482-484.

[2] 白玉,盧春玲,王會(huì)肖,等.建立小鼠糖尿病模型考察降糖膠囊的降糖作用[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(8):61.

[3] 楊明華,楊蘇蓓,柴可夫,等.四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模條件優(yōu)化及穩(wěn)定性考察[J].中藥藥理與臨床,2007,23(5):213-216.

[4] 王柳萍,楊斌,周麗.四氧嘧啶制備小鼠糖尿病模型的影響因素探討[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,21(1):33-35.

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[8] 莊祥云,譯.糖尿病的性別差異[J].日本醫(yī)學(xué)介紹,2001,22 (9):411-412.

D ifferent Effects of Alloxan on Diabetic ModelDuplication in Male and Female An imals

YE Hua-hu,YUAN Ju-fang,LIMin,WANG Yan-jing,DONG Gang,YANGLi-ping, ZHANG Guang-zhou,ZHANG Xiao-fei,ZENGLin
(LaboratoryAnimal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

ObjectiveTo develop a proper animalmodels representing human diabetes,the efficiency and dosesof alloxan in male and female animalswas investigated。MethodsAlloxan were administered to beagle dogs and mice with different dosage.Blood glucose was tested after trea tment at the 3rd,7th,14th,and 21th day,respectively。ResultsThe different effects of alloxan on the blood glucose concentration was showed in female and male animals.After identical doses of alloxan injected,the blood glucose concentration in female animals increased quickly and its peak was higher than that in male animals.About 70% female dogs were successfully induced to become diabetic models with 40 mg/kg alloxan, corresponding only 40% formale dogs(P<0.01).The most optimum dose of alloxan formale dogswas 50 mg/kg,but 3 female dogs(30%)injectedwith this doseswere dead because of higher blood glucose concentration.Similarphenomenons were found in mice and themostoptimum dose of alloxanwas 200 mg/kg and 250 mg/kg for female and male respectively。ConclusionSensitivity of alloxan to female is higher than that to male.For male animals,the dose of alloxan used to duplicate diabetic animalmodelswould be higher about 20%than that for female animals.

Alloxan;Diabetic;Model,animal;Blood glucose

R587.1

A

1671-7856(2010)01-0019-04

2009-10-19

葉華虎(1970-),男,博士,主要從事新藥評(píng)價(jià)研究。E-mail:huahuy@gmail.com