莫諾苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經功能的影響

相 婕,許棟明,王 文,云彩麟,張 麗,艾厚喜,李 林

(1.內蒙古醫學院藥學院,呼和浩特 010059;2.首都醫科大學宣武醫院藥物室,教育部神經變性病學重點實驗室,北京 100053;3.科技部火炬高技術產業開發中心,北京 100038)

研究報告

莫諾苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經功能的影響

相 婕1,許棟明3,王 文2,云彩麟1,張 麗2,艾厚喜2,李 林2

(1.內蒙古醫學院藥學院,呼和浩特 010059;2.首都醫科大學宣武醫院藥物室,教育部神經變性病學重點實驗室,北京 100053;3.科技部火炬高技術產業開發中心,北京 100038)

目的觀察中藥山茱萸的有效成分莫諾苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經功能的影響。方法W istar雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、莫諾苷小劑量組 (30 mg/kg)、莫諾苷中劑量組 (90 mg/kg)、莫諾苷大劑量組 (270 mg/kg)、維生素 E(VE)(35 mg/kg),采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,缺血 30 min后再灌注 3 d,應用 Zea Longa法、爬網格、平行木、吊繩、Ludmila Belayev 12分評分法,觀察莫諾苷對神經功能缺損的改善作用。結果與模型組比較,莫諾苷給藥組(小、中、大劑量)Zea Longa法評分均差異極顯著﹙ P<0.01);與模型組比較,莫諾苷給藥組 (小、中、大劑量)吊繩法評分均差異極顯著 (P<0.01);Ludmila Belayev 12分評分法評分與模型組比較,莫諾苷大劑量組差異極顯著﹙ P<0.001),中劑量組差異極顯著﹙ P<0.01)。結論莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠有改善行為學評分的作用。

莫諾苷;大鼠;局灶性腦缺血再灌注;神經功能;行為學

缺血性腦卒中是由于腦血流受阻而導致的神經損傷和凋亡,表現為神經功能障礙甚至死亡[1],具有發病率高、死亡率高、致殘率高的特點。其高致殘率給社會和家庭均帶來沉重的負擔,但其治療手段卻十分有限[2],因此從天然藥物中開發新的腦保護藥顯得十分重要。以往研究發現山茱萸環烯醚萜苷對D-半乳糖致腦老化癡呆小鼠模型及光化學誘導的腦梗死大鼠模型均具有改善作用,并能提高隔海馬穹隆傘切斷擬Alzhe imer病(AD)模型大鼠的學習記憶功能,明顯減少模型鼠內側隔核區和海馬齒狀回多形層神經元的喪失[3-5]。莫諾苷是山茱萸環烯醚萜苷的主要成分之一,研究發現莫諾苷具有抗氧化損傷和抗凋亡等神經保護作用[6,7]。本實驗觀察莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠神經功能缺損的影響。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備,用 HPLC分析,純度 98.5%。維生素 E:北京雙鶴藥業。

1.2 實驗動物分組及給藥

60只 SPF級W istar雄性成年大鼠,體重 260～280 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2007-0001]。隨機分為:假手術組,模型組,莫諾苷小 (30 mg/kg)、中 (90 mg/kg)、大 (270 mg/kg)劑量組和維生素 E組 (35 mg/kg)各 10只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術后連續灌胃給藥 3 d,每天給藥 1次,其中假手術組和模型組給予等量生理鹽水。

1.3 模型制備

局灶性腦缺血再灌注模型采用改良 Zea Longa's線栓法[8]制備。大鼠用 10%水合氯醛 0.35 mL/kg腹腔注射麻醉,鈍性分離右側頸總動脈 (CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈 (I CA),結扎頸外動脈和頸總動脈的近心端。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內動脈分叉處用眼科剪作一斜行細切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,推動尼龍線進入頸內動脈,進入距頸外動脈和頸內動脈分叉處約 2 cm時,會有阻擋感,說明栓線已越過 MCA,到達大腦前動脈(ACA)的起始部。記錄栓塞開始時間。縫合肌肉、皮膚。栓塞后 30 min拔出尼龍線。假手術組的大鼠,除不插入尼龍線外,其他操作與手術組相同。

1.4 神經功能學評價

術后待動物清醒后及連續灌胃給藥 3 d后分別進行行為學評分。

1.4.1 Zea Longa法 (Zea Longa's method)(5分)[8,9]:0分:無神經功能損傷;1分:輕微神經功能缺損,不能完全伸展對側前爪;2分:對側前肢屈曲; 3分:輕度向對側轉圈;4分:嚴重向對側轉圈;5分:對側偏癱。

1.4.2 爬網格 (Grid test)(5分)[10]:計數大鼠前后肢每米漏空次數以評價前后肢的運動協調能力。0分:無錯誤;1分:≤1次錯誤 (1次);2分:>1次錯誤 (2次);3分:>2次錯誤(3次);4分:>3次錯誤(>3次);5分:不能前進。

1.4.3 平行木 (Beam-walking test)(5分)[11]:計數大鼠穿越平行木跌倒次數以評價運動協調能力。0分:穿過平行木不跌倒;1分:穿過平行木跌倒機會<50%;2分:穿過平行木跌倒機會 >50%;3分:穿過平行木,但受累的癱瘓后肢不能幫助向前移動;4分:不能穿過但可坐在上面;5分:放在平行木上會掉下來。

1.4.4 吊繩 (Prehensile traction test)(3分)[12]:記錄大鼠前爪抓握時間以評價前肢肌力。0分:5 s以上并且后腿可以放在繩上;1分:5 s;2分:3～4 s;3分:0～2 s。

1.4.5 Ludmila Belayev 12分評分法 (Ludmila Belayev'smethod)[13]:提尾懸空 (2分)0分:無明顯神經功能缺失;1分:梗死對側肢體輕度屈曲;2分:梗死對側肢體屈曲明顯。

肢體放置,分為視覺亞試驗 (前方、側方)和觸覺亞試驗 (前方、側方)(8分)0分:動物肢體放置反應正常;1分:反應延遲但不超過 2 s;2分:反應延遲且 >2 s。

本體覺亞試驗 (2分)0分:與對側比肢體同樣有力;1分:與對側比肢體稍有力;2分:與對側比肢體無力。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 Zea Longa法(Zea Longa's method)[8,9](5分)

術后當天,測得 Zea Longa評分,各組分別與假手術組 (0.00±0.00)比較,模型組 (3.80±0.31)、莫諾苷小劑量組 (3.80±0.17)、莫諾苷中劑量組(3.70±0.21)、莫諾苷大劑量組 (3.30±0.33)、維生素 E組 (3.20±0.31)均差異極顯著 (P<0.001),表明手術組有顯著的神經功能損傷;連續灌胃給予莫諾苷 3 d后,測得 Zea Longa評分,各組分別與模型組 (3.00±0.52)比較,莫諾苷小劑量組 (1.50± 0.22)、莫諾苷中劑量組 (1.70±0.21)、莫諾苷大劑量組 (1.30±0.33)均差異極顯著 (P<0.01),維生素 E組 (1.00±0.45)有極顯著性差異 (P<0.001),表明莫諾苷給藥組大鼠神經功能有顯著的恢復 (圖1)。術組有顯著的神經功能損傷;連續灌胃給予莫諾苷3 d后,測得吊繩評分,各組分別與模型組 (2.80± 0.70)比較,莫諾苷小劑量組 (3.80±0.48)、莫諾苷中劑量組 (3.80±0.79)、莫諾苷大劑量 (3.50± 0.50)、維生素 E組 (2.30±0.71)均有降低評分的趨勢,對損傷的神經功能有一定的恢復作用(圖 2)。

圖 1 Zea Longa法評分結果Fig.1 The effect of Zea Longa'smethod

2.2 爬網格(Grid test)[10](5分)

術后當天,測得爬網格評分,各組分別與假手術組 (0.70±0.21)比較,模型組 (4.00±0.37)、莫諾苷小劑量組 (4.30±0.33)、莫諾苷中劑量組 (4.50 ±0.22)、莫諾苷大劑量組 (4.50±0.34)、維生素 E組 (3.80±0.17)均差異極顯著 (P<0.001),表明手

圖 2 爬網格評分結果Fig.2 The effect of Grid test

2.3 平行木(Beam-walking test)[11](5分)

術后當天,測得平行木評分,各組分別與假手術組 (1.20±0.40)比較,模型組 (3.70±0.61)、莫諾苷小劑量組 (3.80±0.40)、莫諾苷中劑量組 (3.80 ±0.40)、莫諾苷大劑量組 (4.70±0.21)均差異極顯著 (P<0.001),維生素 E組 (2.80±0.48)有顯著性差異(P<0.05),表明手術組有顯著的神經功能損傷;連續灌胃給予莫諾苷 3 d后,測得吊繩評分,各組分別與模型組(2.80±0.79)比較,莫諾苷小劑量組 (3.50±0.84)、莫諾苷中劑量組 (3.30± 0.67)、莫諾苷大劑量 (2.80±0.48)、維生素 E組(2.50±0.50)有降低評分的趨勢,對損傷的神經功能有一定的恢復作用(圖 3)。

2.4 吊繩(Prehensile traction test)[12](3分)

術后當天,測得吊繩評分,各組分別與假手術組(0.20±0.17)比較,模型組 (2.30±0.33)、莫諾苷小劑量組 (2.00±0.37)、莫諾苷中劑量組 (2.20± 0.31)、莫諾苷大劑量組(2.50±0.22)、維生素 E組(2.20±0.40)均差異極顯著(P<0.001),表明手術組大鼠有顯著的神經功能損傷;連續灌胃給予莫諾苷 3 d后,測得吊繩評分,各組分別與模型組 (1.20 ±0.48)比較,莫諾苷小劑量組 (0.20±0.17)、莫諾苷中劑量組 (0.20±0.17)、莫諾苷大劑量 (0.20±0.17)、維生素 E組 (0.00±0.00)均差異極顯著 (P <0.01),表明莫諾苷給藥組大鼠神經功能有顯著的恢復(圖 4)。

圖 3 平行木評分結果Fig.3 The effect ofBeam-walking test

圖4 吊繩評分結果Fig.4 The effect of Prehensile traction test

2.5 Ludm ila Belayev 12分評分法 (Ludm ila Belayev'smethod)[13]

術后當天,測得 Ludmila Belayev 12分評分,各組分別與假手術組 (0.00±0.00)比較,模型組(9.30±0.92)、莫諾苷小劑量組 (8.50±0.76)、莫諾苷中劑量組 (9.20±1.05)、莫諾苷大劑量組(9.20±1.01)、維生素 E組(7.50±1.06)均差異極顯著(P<0.001),表明手術組大鼠有顯著地神經功能損傷;連續灌胃給予莫諾苷 3 d后,測得 Ludmila Belayer 12分評分,各組分別與模型組 (6.30± 1.17)比較,莫諾苷大劑量組 (3.00±0.82)、維生素E組 (2.30±1.58)均差異極顯著 (P<0.01)、莫諾苷中劑量組 (4.00±0.58)具有顯著性差異 (P< 0.05),表明莫諾苷給藥組大鼠神經功能有顯著的恢復(圖 5)。

圖 5 Ludmila Belayev 12分評分法結果Fig.5 he effect ofLudmila Belayev'smethod

3 討論

在腦缺血早期,自由基損傷、興奮性神經毒性和反復細胞膜去極化導致能量衰竭,引起級聯式“瀑布反應”,破壞了“神經血管單元”(neurovascular unit)[14]穩態,導致神經元凋亡以及微血管、血腦屏障破壞。腦組織由于缺血缺氧,能量耗竭而導致腦細胞缺血壞死,相應支配區出現運動、感覺和語言障礙。局灶性腦缺血神經癥狀的主要特點為缺血對側的肢體癱瘓或神經肌肉運動功能缺損[15],促進缺血后的神經功能的恢復是臨床考查重要指標,也是腦保護藥物開發研究的重點之一。

本研究采用了大鼠 tMCAO/R模型,造成局部腦缺血再灌注損傷,模型鼠出現了手術側表現出Honer癥出現強迫體態和對側前肢偏癱,爬行時向偏癱側轉圈、追尾等相應癥狀[16,17],Zea Longa法、吊繩、Ludmila Belayev12分評分數據統計結果顯示,手術組與假手術組比較均具有非常顯著性差異。

本實驗選擇腦缺血再灌注 3 d的目的在于考查莫諾苷在急性期對模型鼠的患肢感覺、運動和肌力功能的恢復作用。Zea Longa[8,9]法評測大鼠前肢的運動能力,莫諾苷給藥組大鼠前肢的運動能力有改善(P<0.01),同時與對側肢體相比較,肢體的不平衡性有一定程度的降低。吊繩[12]考查大腦中動脈栓塞再灌注大鼠前肢肌力恢復狀況,莫諾苷給藥組大鼠的前肢肌力有明顯的恢復 (P<0.01),吊繩平均持續時間大于 5 s。Ludmila Belayev 12分評分法[13]檢測前后肢的感覺、運動能力,術后模型組大鼠患側的肢體感覺遲鈍,視覺損傷,肢體屈曲嚴重,給藥 3 d后,大鼠患側肢體感覺明顯改善,視覺有所恢復,肢體屈曲度有所降低 (P<0.05)。爬網格法[10]和平行木法[11]觀察前后肢的運動協調度,實驗中我們發現莫諾苷給藥組有增加肢體的運動協調能力的趨勢,統計無差異。實驗結果表明,莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經功能有改善作用,具有促進恢復模型鼠前肢、肌肉的感覺、運動能力和肌力的作用。本課題前期研究發現莫諾苷具有抗氧化應激和抗凋亡的作用[6,7],提示抗氧化應激和抗凋亡可能是莫諾苷促進神經血管單元再生與神經功能的恢復的機制之一,在促進神經功能恢復方面具有良好的應用前景。

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M orron iside Ameliorate Focal Cerebral Ischaem ia-reperfusion Injury Induced Neurological Function Deficits in Rats

X IANG Jie1,XU Dong-ming3,WANGWen2,YUN Cai-lin1,ZHANGLi2,A IHou-xi2,L ILin2
(1.Department of Pharmacy,InnerMongoliaMedical College,Hohhot 010059,China; 2.Department of Pha rmacology,Xuanwu Hospital of CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;3.Torch High Technology IndustryDevelopment Center,TheMinistry of Science and Technology of the P.R.C.,Beijing 100038,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Morroniside which was isolated from Cornus of ficinalis on recovery of neurological function after focal cerebral ischemia reperfusion in rats。MethodsW istar male rats were randomly divided into sham operated group,model group and Morroniside-low(30 mg/kg),Morroniside-middle(90 mg/ kg),Morroniside-high(270 mg/kg),vitamin E(35 mg/kg).Focal stroke was induced in adult rats by 30 minutes right middle cerebral artery occlusion reperfusion injury( tMCAO/R).To examine the recovery of neurological function,we measured Zea Longa'smethod,Grid test,Beam-walking test,Prehensile traction test,Ludmila Belayev'smethod on the third day after operations in rats.Result The above mentioned indexes,including Zea Longa's method,Prehensile traction testin theMorroniside-treated group showed differences compared with those in the model group(P<0.01)on the third day after the rightmiddle cerebral artery occlusion reperfusion injury( tMCAO/R)in rat,and Ludmila Belayev'smethod in the Morroniside-treated group showed differences compared with those in the model group (P<0.001). Conclusion Morroniside ameliorate focal cerebral ischaemia-reperfusion injury induced neurological function deficits in Rats.

Morroniside;Rat;Focal cerebral ischemia reperfusion;Neurological function;Behavior tests

R743.31

A

1671-7856(2010)01-0010-05

2009-09-07

“重大新藥創制”科技重大專項 (2009ZX09103-366),國家自然科學基金項目 (30740053);北京市自然科學基金項目(7062031)。

相婕(1984-),女,碩士生,主要研究方向:神經藥理、中藥藥理。E-mail:xj_840129@yahoo.cn

王文,男,博士,副研究員,主要從事天然藥物對腦重大疾病干預研究。E-mail:lzwwang@yahoo.com.cn

云彩麟,女,碩士,教授,主要從事神經藥理學、毒理學與中蒙藥藥理的研究。E-mail:nmycl@163.com