高效產脂肪酶菌株C1的分離鑒定與酶學性質研究

于玉鳳 ，陸兆新 ，盧亞萍 ， ，劉茜茜 ，陳舟舟

（1.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）是一類重要的甘油酯鍵水解酶，廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中，可以在油水界面上催化脂類物質分解、合成和酯交換反應，是最早研究的酶類之一[1]。微生物脂肪酶具有種類多，比動物脂肪酶更廣的作用pH值和作用溫度范圍，便于進行工業生產和獲取高純度制劑等優點，在食品、制革、飼料等多個行業得到廣泛應用[2-3]。不同種屬的微生物所產生的脂肪酶具有不同的催化特性，發現具有不同催化特性（如耐高溫、耐低溫、耐有機溶劑等）的脂肪酶產生菌以滿足不同的工業生產需求具有重要意義。從自然界中尋找產生優良特性的脂肪酶的菌株，是促進脂肪酶研究與應用的有效途徑之一。筆者從油菜地土壤中分離到一株高效產脂肪酶菌株C1，對其進行了菌種鑒定，并對其酶學性質進行了初步研究，旨在為脂肪酶工程菌株的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣本實驗所用土壤樣品采自江蘇農科院多年種植油菜的試驗田。

1.1.2 培養基 富集培養基：酵母抽提物2 g/L，橄欖油 5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.1 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，自然 pH；初篩培養基：乳化橄欖油 10 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.1 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KCl 0.5 g/L，Agar 15 g/L，自然 pH；羅丹明 B復篩培養基：LB平板中添加0.001%羅丹明B和1%乳化橄欖油；產酶基礎培養基：葡萄糖 10 g/L，酵母抽提物5 g/L，K2HPO42 g/L，橄欖油10 g/L，MgSO40.5 g/L，自然 pH。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選 稱取5 g土壤置于45 mL生理鹽水中，加玻璃珠打散。移取5 mL至45 mL富集培養基，37℃培養2～4 d。梯度稀釋富集培養液，涂布到以橄欖油為唯一碳源的初篩平板上，37℃培養2～4 d。從初篩平板上挑取有水解圈的菌落，用無菌牙簽接種到羅丹明B復篩平板上，7℃培養2～4 d。觀察并測量菌落周圍熒光圈的大小。選取熒光圈直徑/菌落直徑較大的菌落，劃線分離后接種到LB中過夜培養，種子液加入產酶基礎培養基中，30℃振蕩培養，24 h后每隔6 h取樣測酶活。

1.2.2 菌種的鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》對篩選的菌體進行表型和生理生化的鑒定。并以C1基因組DNA為模板，16S-F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 16S-R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，通過PCR擴增其16Sr RNA的編碼基因，測序后進行序列比對。

1.2.3 酶活性的測定 參照Lee et al.的脂肪酶活測定方法[4]，略作修改。取10μL發酵上清液，100 μL 10 mM pNPB（對硝基苯丁酯）加入到2.89 mL PBS（pH 7.4）中，37℃進行酶促反應，測定產物對硝基苯酚在410nm處的吸光值。以已知濃度（0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μmol）的對硝基苯酚作標準曲線，計算酶活。每分鐘產生1μmol對硝基苯酚所需的脂肪酶定義為1個酶活單位。

（1）酶的最適溫度和溫度穩定性測定：分別于35～80℃溫度下測定去除菌體的上清發酵液中脂肪酶活力，以測定脂肪酶最適反應溫度。將酶液分別于40～80℃溫度冰浴中保溫1 h和5 h，立即取出冷卻后測定其酶活。

（2）酶的最適pH值和pH穩定性測定：配制不同pH值的0.5 mmol/L緩沖液，包括PBS緩沖液（pH 5.0～8.0），Gly－NaOH 緩沖液（pH 9.0～12.0）。在37℃下對不同pH值的緩沖液測定酶活力，測定酶的最適pH。將酶在37℃，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的緩沖液中（1∶1/v/v）保溫 1 h 和5 h，然后在 37℃，pH 7.4，0.5 mmol/L PBS 緩沖液中測定殘余酶活力，檢測酶的pH穩定性。

（3）酶的有機耐性測定：選取極性不同的有機溶劑，分別取各種有機溶劑25μL與75μL的酶液充分混合后，放在37℃下保溫，處理0.5、4.5、11.5 h后測定其殘余酶活。以加入相同體積的蒸餾水為對照，并定義為100%酶活。

1.2.4 酶的金屬離子耐性測定 選取常見的金屬離子，將0.1 mol/L相對應的金屬離子10μL與90 μL酶液充分混合后，放入37℃條件下保溫1 h，測定其殘余酶活。同樣以加入相同體積的蒸餾水為對照，并定義為100%酶活。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的篩選與生理生化特性鑒定 通過多輪初篩和復篩，得到40株產脂肪酶的細菌。從羅丹明B復篩平板上挑取有明顯水解圈的菌落（見圖1），接種到基礎產酶培養基中培養。在培養至72 h時，其中的一株產酶量最高，酶活可達到28.5 U/mL，命名為C1。C1菌落呈白色，表面光滑不透明，突起，易挑起，有淡淡的異味，結合其生理生化特性（見表1），初步鑒定C1為Burkholderia cepacia。

表1 菌株C1的生理生化特性

2.1.2 16Sr DNA序列分析及系統進化樹的建立經上海生工生物工程技術服務有限公司測序，菌株C1的16Sr DNA序列為2 084 bp，將所得序列在NCBI網頁上進行BLAST比對，結果發現C1的16Sr DNA序列與數據庫中Burkholderia cepacia strain S31 LipA（lipA）和 LipB（lipB）（FJ638612.1）比較接近，相似性達99%。從BLAST比對的結果中選取來源不同的序列，利用軟件MEGA4.1繪制進化樹，從圖2可以看出，進化樹中菌株C1與菌株Burkholderia cepacia（FJ638612.1）位于同一分支，親緣關系最近。根據菌株C1的形態特征、生理生化特征和16Sr DNA序列分析及系統發育構建，鑒定菌株 C1為 Burkholderia cepacia。

2.2 酶學性質研究

2.2.1 酶的最適溫度和溫度穩定性 如圖3所示，酶在65℃時達到最高酶活力，即酶的最適溫度為65℃。

如圖4所示，處理1 h后，其酶活下降較少，其中70℃下仍殘留酶活91.2%；處理5 h后，60℃下殘留酶活76.2%，隨后酶活大幅下降，可見酶的耐溫性較好。

2.2.2 酶的最適pH值和pH穩定性 由于在pH值9.0～11.0條件下，底物分解非常迅速，使得測定數據嚴重失真。因此，圖5中只反映pH值5.0～8.0條件對脂肪酶活力的影響，其中在pH值8.0時，酶活最高，比pH值7.4時酶活多出41.8%，酶的最適pH值為8.0。

由圖6可知，脂肪酶在pH值8時穩定性最高，在pH值5～10范圍內溫育1 h，酶活殘留量均保持在80.0%以上，只在pH值>10以后，酶活大幅下降，只殘留32.9%；溫育5 h后，在pH值9處仍然殘留59.8%的酶活，說明酶具有較穩定的pH耐性。

2.2.3 酶的有機耐性 如圖7所示，酶對正己烷、乙醇、甲醇耐性最好，對乙酸乙酯、甲苯和異丙醇耐性較好，而對苯酚、乙腈和乙酸耐性較差。

2.2.4 酶的金屬離子耐性 如圖8所示，K+、Mg2+對脂肪酶活性有明顯促進作用；Na+、Mn2+、Zn2+和 Fe3+對脂肪酶活性有微弱的抑制作用，殘留酶活保持在80.0%以上；而Ca2+和Cu2+對脂肪酶活性有嚴重抑制作用，殘留酶活在35.0%以下。

3 結論

圖8 金屬離子對脂肪酶穩定性的影響

本研究從土壤中篩選得到了一株高效產脂肪酶的菌株C1，經形態特征、生理生化特征和16Sr DNA序列分析鑒定為Burkholderia cepacia。對其所產脂肪酶的酶學性質進行研究，結果表明，酶的最適溫度為65℃，最適pH值為8.0。酶的溫度耐性較好，70℃下溫育1 h殘留酶活91.2%，60℃ 下溫育5 h殘留酶活76.2%；酶的pH耐性優良，在pH值5.0～10.0范圍內處理1 h，酶活殘留量均保持在80.0%以上，在pH值5.0～9.0范圍內處理5 h，酶活殘留量均在59.8%以上；酶對正己烷、乙醇、甲醇具優良的耐性，對乙酸乙酯、甲苯和異丙醇耐性較好，而對苯酚、乙腈和乙酸耐性較差；K+、Mg2+對脂肪酶活性有明顯促進作用，Na+、Mn2+、Zn2+和 Fe3+對脂肪酶活性有微弱的抑制作用，而Ca2+和Cu2+對脂肪酶活性有嚴重抑制作用。與吳繼光[5]、趙春雷[6]等的研究相比，該脂肪酶的溫度耐性明顯較強，且經過對其發酵條件的優化，其產酶活性可大幅提高，此脂肪酶具有較大的工業應用價值。

[1]Jaeger K E，Eggert T.Lipases for biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（4）：390-397.

[2]劉海洲，劉均洪，張媛媛，等.微生物脂肪酶的最新應用研究進展[J].食品研究與開發，2009，30（1）：141-143.

[3]GUPTA R，GUPTA N，RATHI P.Bacterial lipases：an overview of production，purification and biochemical properties [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64：763-781.

[4]Lee D W，Koh Y S，Kim K J，et al.Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1[J].FEMSMicrobiology Letters，1999，179：393-400.

[5]吳繼光，舒正玉，程藍骍，等.耐受有機溶劑洋蔥伯克霍爾德菌ZYB002全細胞脂肪酶酶學性質 [J].微生物學通報，2010，37（1）：2-6.

[6]趙春雷，閆麗娟，謝振榮，等.一株耐熱脂肪酶產生菌的篩選及酶學性質研究[J].生物技術通報，2010，（2）：185-188.