影響玉米幼胚愈傷組織誘導及植株再生因素的研究

王小紅

（南通農業職業技術學院，江蘇 南通 226006）

生物技術的迅速發展為加快玉米育種進程開辟了新途徑，玉米體細胞培養技術不斷取得進展。利用玉米不同器官作外植體進行組織培養的研究顯得格外重要。研究建立有效的組織培養系統，從中獲得大量再生植株是玉米育種工作的首要前提。自1975年Green首次從玉米未成熟胚培養出愈傷組織，并成功地獲得了再生植株以來，玉米幼胚培養技術有了快速發展。雖現在幾乎能從玉米各個部位誘導出愈傷組織，但幼胚是最易誘導也是使用最多的外植體。誘導玉米幼胚產生胚性愈傷組織及胚性愈傷組織分化受諸多因素的影響，包括基因型、培養基組成和培養條件、幼胚大小等。筆者選用抗性好、適宜本地種植的玉米自交系幼胚進行了外植體的愈傷組織誘導研究，旨在建立具有胚性的愈傷組織培養體系，為玉米遺傳轉化提供受體材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為玉米自交系515、齊319、魯原 341、502，海南種植。

1.1.2 試劑與儀器 抗生素、生長素、封口膜等購于上海生工。烘箱、離心機、超凈工作臺、氣候箱等由南通農業職業技術學院生物技術實驗室提供。

1.1.3 培養基 （1）MS誘導培養基：MS培養基+0.5 g/L Pro、40 g/L 蔗糖、0～2.5 mg/L 2，4-D 、0.5 mg/L氨基苯甲酸、0.5 mg/L泛酸鈣、0.25 mg/L核黃素；（2）MS繼代培養基：MS培養基+1.0 mg/L 、0.5 g/L Pro、30 g/L 蔗糖；（3）分化培養基：MS 培養基+30 g/L蔗糖、0～2 mg/L 6-BA ；（4）生根培養基：N 6 培養基+20～30 g/L 冰糖、5 g/L 活性炭、1 mg/L 6-BA 。

1.2 方法

1.2.1 幼胚的預處理 取授粉后11～13 d的玉米果穗，剝去最外兩層苞葉。用70%乙醇噴灑苞葉表面，然后剝去層層苞葉，當剩最后一層時，再用70%乙醇噴灑苞葉表面，立刻將果穗轉入超凈工作臺。去掉苞葉和花絲，用解剖刀削去子粒頂部2/3胚乳，用鑷子從中上部挑出幼胚（幼胚大小最適0.8～2.0 mm）。盾片朝上放入誘導培養基，避光、27℃下誘導出愈傷組織。

1.2.2 玉米愈傷的繼代培養 誘導出的長勢好的愈傷組織夾成2～3 mm大小的塊，在繼代培養基培養，約10～12 d繼代一次，進行愈傷組織的增殖。培養溫度為28℃，光照10～12 h/d，光照強度800～1 000 Lx，日光燈照明。

1.2.3 愈傷組織再分化及植株的再生 將抗性的愈傷挑入分化培養基中光照培養，再生植株。當再生苗在三角瓶中長到6～9 cm高時，將其移到小的花盆中(下層為滅菌的壤土，上層為蛭石)，每天澆l/10 MS營養液，并套袋保濕，在大棚中培養10 d左右，移栽到土壤中。

1.2.4 影響愈傷組織誘導的各因素 （1）胚齡和基因型對胚性愈傷組織誘導率的影響：分別取授粉后8、9、10、11、12、13 d(海南地區夏播)的玉米幼胚，幼胚長度約在1～3 mm左右，基因型分別為齊319、515、魯原 341、502，在加有 0.5 m g/L 2，4-D 的誘導培養基上培養，在20 d左右統計胚性愈傷組織的誘導率，并對胚齡和基因型兩因素進行隨機試驗方差分析。（2）2，4-D濃度對胚性愈傷組織誘導的影響：取授粉10 d的齊319、魯原34的玉米幼胚，在 2，4-D 濃度為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的誘導培養基上培養，25 d后統計胚性愈傷組織塊數。

2 結果與分析

2.1 影響愈傷組織誘導的因素

2.1.1 胚齡對胚性愈傷組織誘導率的影響 如表1所示，胚齡9 d的魯原341胚性愈傷組織誘導率最高，可以達到98.5%，其他基因型授粉10 d左右的幼胚最高。13 d的幼胚胚性愈傷組織誘導率很低，最高的齊319也只有76.8%。從表1可以看出，10 d胚齡的幼胚誘導率最高，平均達到88.09%，13 d的最低，平均只有65.90%。胚齡對于胚性愈傷組織的誘導率差異比較顯著。從技術的可操作性和培養性狀來講，10 d左右的幼胚一般在1.2～1.5 mm左右，胚性愈傷組織誘導率高，幼胚容易從雌穗上剝離，實驗可操作性強。胚齡較大的幼胚在誘導培養基上容易萌發，誘導出的愈傷組織發粘、胚性差、不易繼代。

表1 不同基因型玉米幼胚不同生長天數下的胚性愈傷組織誘導率 （%）

2.1.2 基因型對胚性愈傷組織誘導率的影響 從表1的數據和分析中可以看出齊319的胚性愈傷組織誘導率平均最高，達到87.08%，502的最低，只有61.44%。其中502誘導出的愈傷組織大部分發粘，H型胚性愈傷組織少，不易繼代培養；齊319與魯原341誘導的H型愈傷組織多，松脆，淡黃色，胚性好。說明不同的基因型在相同2，4-D濃度的培養基上誘導，胚性愈傷組織誘導率有顯著差異，由此看出基因型是影響玉米遺傳轉化的一個重要因素。

2.1.3 2，4-D濃度對胚性愈傷組織誘導的影響2，4-D對愈傷組織的誘導和生長非常有效，在組織培養中一般用其作為培養基中的生長激素。培養基中2，4-D的濃度對玉米愈傷組織的誘導影響極大。如表2所示，齊319在1.0 m濃度上胚性愈傷組織誘導率最高，達到97.8%，而魯原341在0.5 mg/L上誘導率最高，達到98.5%。可見2，4-D濃度對玉米幼胚的胚性愈傷組織誘導率有很大影響，而不同基因型的最大誘導率所需的2，4-D濃度也不相同。為防止2，4-D濃度過高影響玉米愈傷組織的分化，誘導培養基的2，4-D濃度最高不超過2 mg/L。

表2 2，4-D濃度對愈傷組織誘導率的影響 （%）

2.2 影響愈傷組織繼代的因素

2.2.1 繼代時間的影響 愈傷組織在繼代的前2～3 d，處于靜止生長期，生長緩慢，4～5 d后愈傷組織明顯膨大，周緣開始長出米粒狀的新愈傷組織，此時生長進入對數生長期，10～12 d以后，愈傷組織生長開始緩慢，進入延遲生長期，此時要進行繼代培養。否則愈傷組織容易失去胚性，不易分化成苗。繼代時間的長短是愈傷組織能否長期保持胚性的關鍵因素之一，在對數生長期或對數生長后期進行繼代，能夠長時間保持愈傷組織的胚性。繼代時愈傷組織夾成2～3 mm的小塊轉移到新的繼代培養基上，夾取顏色鮮黃、較脆的胚性愈傷組織進行繼代較好。

2.2.2 生長素濃度對繼代的影響 繼代培養基的2，4-D濃度一般為1 mg/L，愈傷組織生長旺盛，且可以長期保持胚性。2，4-D濃度過高會使愈傷組織受到傷害，同時也可以增加無性系變異2，4-D濃度過低愈傷組織生長緩慢，長勢不好，不利于繼代。

2.3 影響愈傷組織再生的因素

2.3.1 AgNO3對玉米再生率的影響 試驗表明，在培養基上添加8 mg/L AgNO3可以明顯提高玉米再生率。當AgNO3濃度高于20 mg/L時，愈傷組織多數出現只長根，不長芽現象，或者只是產生一些胚狀根，雖然有綠點，但是無法形成真正的綠苗。

2.3.2 MET對玉米再生苗的影響 由于三角瓶中濕度大，光線弱，培養基營養成分豐富，玉米再生苗在基本培養基上生長快、莖稈細、節間長、葉片發黃、植株弱小、根系不發達、移栽后不易成活。試驗發現培養基中添加2 mg/L MET可以有效抑制玉米苗徒長，苗粗壯健康，節間縮短，葉色發綠，根系發達，移栽后容易成活。

3 結論與討論

（1）在培養基的選擇上，主要采用MS和N6培養基，二者對于不同品種和品系玉米愈傷組織的植株再生影響不同。對于誘導產生出胚性愈傷組織，MS比N6效果好，若由幼胚直接再生植株，則N6培養基效果更好，MS與N6的主要區別在于氮源的形式不同。此外激素的選擇也影響愈傷組織的生成，2，4-D是影響組織脫分化的關鍵因素，較高濃度的2，4-D誘導外植體脫分化產生愈傷組織，降低或不加2，4-D愈傷組織才能分化出完整的胚狀體，并再生出小植株。在誘導愈傷組織和繼代過程中，培養物有三種類型：Ⅰ型：結構緊密，不易分開，這種愈傷組織很容易分化成芽和根或胚狀體，但不易繼代培養。Ⅱ型：結構松軟，白色透明，很容易繼代培養，但喪失了分化能力。Ⅲ型：介于Ⅰ型和Ⅱ型之間，具有明顯的顆粒狀結構，白色或淺黃色，具有分化胚狀體的能力，而且又能繼代培養。因此，把第三種類型篩選出來，才能使繼代培養的愈傷組織保持它的分化能力。

（2）根據玉米愈傷組織的類型，可以挑選合適的愈傷組織進行分化培養。愈傷組織分化是不整齊的，這是因為在愈傷組織繼代中并沒有進行同步培養有關。分化率的高低與基因型和培養基有很大的關系，而在繼代中表現好的自交系其分化率也相對較高。但不同的基因型材料還應進一步作不同培養基的試驗，以提高愈傷組織的分化率。所有材料在繼代過程中都有分化現象出現，有的出現綠點，應視愈傷組織生長情況及時調整激素濃度及比例，如分化明顯，根毛及芽較多應提高2，4-D濃度，降KT或BA濃度，反之則相反。但2，4-D濃度不宜超過4 mg PL，也不能在高濃度2，4-D條件下繼代時間過長，一旦受到此影響，材料的分化能力就很難恢復。

（3）本實驗所用的4個材料均能誘導出愈傷組織，表明玉米幼胚愈傷組織的誘導具有普遍性，但各個材料問的誘導率差別較大，實驗表明基因型對玉米愈傷組織的產生有著重要影響。Spencer等的研究發現，玉米的基因型、幼胚大小及植株的發育狀態是影響玉米幼胚培養及植株再生的重要因素，其中玉米的基因型影響特別大。實驗也表明濃度對愈傷組織的誘導和生長非常有效，這與王雷等在誘導玉米愈傷組織時的發現一致。中國科學院上海植生所黃璐等認為，2，4-D雖然可以起到誘導的作用，但其對外植體及愈傷組織的傷害作用較大，故誘導時所采取的濃度不易過大，以減少組織培養中的無性系變異。

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