豌豆和玉米遠緣雜交后代的SRAP分析

朱培坤 ，李朝陽 ，李 菁 ，李 鸝

（1.深圳市百綠生物染色體雜交研究所，廣東 深圳 518172；2.吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000）

野生近緣雜交是優(yōu)良農(nóng)藝性狀獲得的重要途徑之一，通過種間雜交及后代選育，可得品質(zhì)優(yōu)良的作物新品種。遠緣雜交是屬以上的種間雜交，容易存在雜交不親和及后代不育等現(xiàn)象，給新品種育種帶來困難。近期在植物屬間遠緣雜交方面取得了很大的進展，目前已在多個屬間如小麥屬與黑麥屬[1]、偃麥草屬[2]、草莓屬[3]，動物如雞與鵪鶉等[4]的屬間遠緣雜交取得了成功。遠緣雜交的成功給農(nóng)作物雜種生產(chǎn)，改良農(nóng)作物品質(zhì)帶來了曙光。

豌豆屬蝶形花科豌豆屬植物，玉米屬禾本科玉米屬植物，二者分屬雙子葉植物綱和單子葉植物綱。近期有學者嘗試將豌豆與玉米進行了遠緣雜交，并獲得了可育的后代[5]。研究其雜種后代的遺傳基礎，對評價其雜種后代真實性以及進一步研究利用有重要意義。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是一種新的DNA分子標記，具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列等特點，廣泛應用于圖譜構(gòu)建、性狀的標記、遺傳多樣性分析以及雜交后代真實性的鑒定[6]。本實驗對豌豆和玉米雜交后代進行SRAP分析，檢測其雜交后代的真實性，以期為該雜交后代的合理開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供體豌豆（Py）、受體玉米（MF、M540）、雜交后代（Py-MF和Py-M540）種子都由深圳百綠生物科技有限公司提供[5]。試驗于2008年4月將5個供試種進行播種，生長期記錄生長狀況，7月采集各植株葉片進行相關(guān)試驗。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取5個類型植株的葉片混合，改良CTAB法提總DNA。

1.2.2 PCR擴增及檢測 從42對SRAP引物中篩選出10對引物進行擴增（引物序列見表1）。擴增程序為：94℃ 預變性 5 min；94℃ 變性 1 min，35℃復性1 min,72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復性 1 min，72℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后在英國UVP公司的GDS 7500凝膠成像系統(tǒng)中成像，拍攝并保存結(jié)果。

表1 試驗所用SRAP引物

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 將電泳得到的擴增圖譜的每一條帶都代表引物的結(jié)合位點。有擴增條帶記為1，無帶記為0，強帶和弱帶的賦值都為1。對于多態(tài)位點，將在重復試驗中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析。利用GenePOP軟件對RAPD分析所得到的表型矩陣進行遺傳參數(shù)分析。僅計算Nei′s遺傳距離（D），并根據(jù) Nei′s遺傳距離，利用 GenePOP 軟件的UPGMA法分析居群間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米生長期形態(tài)差異觀察

如圖1所示，從幼苗開始，Py-M540的莖尖嚴重右向卷曲，導致莖尖橫向生長，故植株矮小且節(jié)間短，莖稈瘦弱，株高僅為受體M540的一半，但成熟葉片與受體M540的葉形無差別，M540的莖尖也有輕微卷曲，但仍然向上生長。而同一供體的另一雜交后代Py-MF則表現(xiàn)出與Py-M540完全不同的形態(tài)特征：長勢強壯，葉片短而寬大，葉片基部夾角非常小，幾乎與莖稈平行的成簇上伸，并不卷曲，節(jié)間非常短，其受體MF的莖尖也不卷曲，葉片長而寬，節(jié)間長。

圖1 受體玉米及其雜交后代的生長期形態(tài)特征

2.2 10對引物對豌豆和玉米及其雜交后代的擴增結(jié)果

對42對SRAP引物進行篩選擴增，最終選擇了擴增條帶清晰，多態(tài)性強的10對引物對Py、MF、M540、Py-MF和Py-M540進行了擴增，共獲得105條重復性高的清晰條帶，其中有101條為多態(tài)，多態(tài)比率（PPB）為96.19%。

2.3 供體和受體基因在2個雜交后代中的表達

10 對引物中，me1-em9、me1-em3、me1-em4、me2-em1和me4-em8 5對引物在Py-M540和Py-MF中擴增出雙親特異帶（圖2）。在Py-MF和Py-M540中出現(xiàn)了Py的特征帶（圖中箭頭所指），表明2個后代具有雙親的遺傳物質(zhì)，豌豆的遺傳物質(zhì)進入了玉米基因組，此結(jié)果從DNA分子水平上初步證實了Py-M540和Py-MF可能是豌豆和玉米雜交的真實后代。

圖2 豌豆和玉米雜交后代的SRAP驗證

2.4 SRAP標記的聚類分析

根據(jù)SRAP引物擴增結(jié)果，對5個樣本進行了遺傳距離計算和聚類分析（表2，圖3）。觀察等位基因數(shù)na=1.961 9，有效等位基因數(shù)ne=1.629 3，Nei基因多樣性指數(shù)h為0.370 3。從遺傳距離比較來看，Py-MF與Py-M540的距離最近，與其親本MF的距離次之，與供體Py的距離最遠。同樣，Py-M540與其親本M540的關(guān)系次于它與Py-MF的關(guān)系距離。以Nei的遺傳距離為基礎作聚類圖，大致可分為3個聚類群，其中供體PY單獨列為一群，2個受體M540和MF列為一群，供體與2個受體的后代PY-M540和PY-MF單獨列為一群。這說明雜種后代的DNA序列發(fā)生了改變，導致后代與親代間的從屬關(guān)系變成了并列關(guān)系。從擴增結(jié)果中后代有Py基因的表達，表明這種改變極有可能來自豌豆基因的插入。

表2 遺傳距離

表2 遺傳距離

注：1——PY、2——M540、3——MF、4——PY-M540、5——PY-MF。

pop ID 12345****12345****1.475 9 0.965 1 1.286 7 1.098 6****0.363 5 0.405 5 0.405 5****0.495 1 0.297 3****0.259 5

圖3 遺傳距離聚類圖

3 結(jié)論與討論

在異源多倍化早期染色體片斷變化是一個比較普遍現(xiàn)象，這可能有利于實現(xiàn)新合成物種快速進化[7]。在染色體分裂的某一特定時期，外源染色質(zhì)的加入導致受體細胞不能識別，外源染色質(zhì)順利參與了受體細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂，從而出現(xiàn)具有外源核小體與受體核小體兩種核小體形成的螺線體和超螺線體[5]。而這種導入極有可能是因為DNA序列在不同染色體組之間迅速變化所造成，這種DNA序列的變化在具有AABB染色體組的四倍體小麥中注入節(jié)節(jié)麥的DD染色體組形成異源六倍體小麥的早期階段被證實。本試驗利用SRAP引物擴增分析表明2個雜交后代的DNA序列也發(fā)生了改變，親本之一的玉米表達出來的條帶在2個雜種后代中基本都有表達，較少消失。此外，2個后代還產(chǎn)生了大量的新帶，多數(shù)更與豌豆相似，后代產(chǎn)生的條帶多樣性遠遠高于各自的親本，也說明了后代的DNA序列確實發(fā)生了改變。

近年來，作為一種新型分子標記，SRAP在物種遺傳多樣性及遠緣雜交特別是屬間雜交的后代鑒定中得到廣泛應用。薛丹丹等[8]利用SRAP標記對結(jié)縷草屬雜種后代的鑒定研究表明，雜交后代的基因重組導致擴增條帶豐富的變異，表現(xiàn)為條帶的增加或缺失，且后代中有父本特征帶的，鑒定為真實雜種后代。高麗霞等在用SRAP標記分析姜花屬間雜交育種時發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系太近或太遠（均值0.4～0.6），都會在后代中受自交不親和性影響，而降低結(jié)實率，由此說明遺傳距離的遠近或許是屬間遠緣雜交成功的一個重要影響因子。本試驗所用材料是不同綱間的種類雜交，但結(jié)果表明，2個雜種后代除了保持各自受體玉米的特征帶且較少消失外，還產(chǎn)生了大量新帶，其中一些條帶與供體豌豆的特征帶一致，可以證明2個雜交后代DNA序列的改變來自于豌豆基因的插入，是豌豆和玉米的真實雜交后代。

[1]張連全，劉登才，顏澤洪，等.遠緣雜交早代穩(wěn)定小麥導入了外源DNA片段并發(fā)生了DNA重排[J].中國科學C輯：生命科學，2005，35（4）：318-325.

[2]Xiaorong Shen,Herbert Ohm.Molecular mapping of Thinopyrumderived Fusarum head blight resistance in common wheat[J].Mol Breeding,2007,20（2）：131-140.

[3]馬洪翔，陳佩度，余桂紅，等.利用GISH和RAPD檢測黃毛草莓×鳳梨草莓種間雜種 [J].植物遺傳資源學報，2005，6（3）：256-261.

[4]米拉古麗，阿米娜，姚守秀，等.利用SRAP標記分析雞、鵪鶉及其屬間雜交種的群體遺傳結(jié)構(gòu)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2010，（5）：1-3.

[5]朱培坤.高等植物的第三類雜交——染色體雜交[J].中央民族大學學報（自然科學版），2009，18（1）：5-10.

[6]于 暉，趙 泓，王力超，等.百合雜交后代的親本基因型鑒定[J].西南大學學報（自然科學版），2010，32（6）：58-63.

[7]耿廣東，張素勤，賈開家，等.提莫菲維小麥與葡萄牙野燕麥遠緣雜交后代的SRAP分析 [J].華北農(nóng)學報，2010，25（1）：110-112.

[8]薛丹丹，郭海林，鄭軼琦，等.結(jié)縷草屬植物雜交后代雜種真實性鑒定——SRAP分子標記[J].草業(yè)學報，2009，18（1）：72-79.