冬蟲夏草ISSR-PCR反應體系的建立與優化

謝 放，朱子雄，田 偉，張 楠

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

冬蟲夏草是我國珍稀名貴中藥材之一[1]。前人在其分類與遺傳多樣性方面已經做了許多工作[2-4]。但他們對冬蟲夏草遺傳多樣性的研究，主要依據RAPD、RFLP、ITS 技術，而側重于蟲草 ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子標記的研究尚未見報道。ISSR是由Zietkiewiez等[5]于1994年提出的用于擴增2個距離較近的相鄰SSR位點間序列的一種方法，較RFLP便宜，比RAPD重復性高，且ISSR多態性高。此外，它不需要知道被檢測物種任何基因組的信息，因此ISSR標記非常適合基因組信息缺乏物種的研究。自該技術發明以來，已被廣泛應用于生物的遺傳多樣性、分子標記及農作物遺傳多樣性的研究中[6]。本試驗旨在明確ISSR-PCR反應中各項參數對試驗結果的影響，建立并優化適用于冬蟲夏草的ISSR反應體系，為進一步研究冬蟲夏草遺傳多樣性奠定基礎。

1 材料與方法

供試物種冬蟲夏草分別采自甘肅省蟲草主要產地：天祝打柴溝鎮東山，甘南合作市合作鎮扎油溝和甘肅漳縣金鐘鎮路骨山。菌種由蘭州交通大學生物種苗工程研究所分離純化，獲得菌株。

1.1 基因組DNA提取及定量

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[4]：在提取DNA過程中加入10%β-巰基乙醇防止酚類物質被氧化發生褐變；采用Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）和 3 mol/L NaAc 溶液（pH 6.0）作為提取液，加速蛋白的變性過程、鹽類物質的沉降以及脂溶性色素的溶解，使獲得的DNA溶液顏色明顯變淺，顯著增加后續提取的DNA的質量。經改良后的方法所提取的基因組DNA都比較理想，符合分子生物學實驗的要求。

1.2 DNA的定量

將DNA溶于TE緩沖液 [10 mM Tris-HCl,l mM EDTA（pH 8.0）]中，從中取出 10 μL 用 TE 稀釋至2 mL，在紫外分光光度計下測量OD260的值，并根據基因組DNA的濃度值進行計算。最后將樣品濃度調至20 ng/μL，于-20℃保存備用，用于ISSR-PCR分析。

1.3 ISSR擴增反應體系及程序

ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶購于TaKaRa公司。試驗以隨機選取的835號引物為固定引物，其序列為：AGAGAGAGAGAGAGAGYC。擴增反應在PCR反應薄壁管中進行，利用Biometra公司的梯度PCR儀進行擴增。

25μL反應體系中各反應物含量為：20 ng模板DNA，10 mmol/L dNTP，20 μmol/L ISSR 引物，1 U TaqDNA 聚合酶，10×PCR Buffer，25 mmol/L MgCl2。

ISSR-PCR擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性 45 s，49℃（48℃～58℃） 退火 45 s，72℃延伸45 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.4 PCR檢測結果

取5μL PCR擴增產物與1μL 6×加樣緩沖液（TaKaRa）混勻，點入含10 mg/mL EB的1.2%瓊脂糖凝膠中，于5 V/cm電場強度下電泳1 h，在UVP凝膠成像系統下觀察照相。

1.5 ISSR反應條件優化

參考紫花苜蓿[8]、鴨茅[9]、檳榔[10]的 ISSR 擴增程序和反應體系，確定最佳反應條件。對反應體系各因素設置不同梯度水平（表1）。在試驗中當對某一因素進行梯度設置時，其余因素均保持不變。在最佳反應體系的基礎上在梯度PCR儀上進行退火溫度篩選，每個梯度設3個重復，篩選出合適的退火溫度。

表1 ISSR反應系統優化設計

2 結果與分析

2.1 DNA檢測

經0.8%的瓊脂糖電泳、UVP凝膠成像系統下觀察檢測DNA，所提取的DNA都為一清晰明亮的主帶。再通過紫外分光光度計測定OD260的值，通過計算得DNA濃度為50～80 ng/L，DNA質量電泳帶無拖尾現象且圖像較為清晰（圖1），可知所提DNA純度較高，RNA和蛋白質含量較少，根據計算將DNA濃度調整為20 ng/μL，于-20℃貯存備用。

圖1 DNA模板電泳檢測圖譜

2.2 Mg2+濃度對ISSR的影響

增加Mg2+的濃度可以增加Taq DNA聚合酶的擴增效率，但會降低PCR的特異性。從圖2可知當Mg2+濃度低于1.5 mmol/L時擴增產物減少甚至沒有；而Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時，譜帶背景變濃且出現彌散現象，主帶不易分辨且小片段譜帶數量開始逐漸減少。因此冬蟲夏草ISSR-PCR反應中Mg2+最佳濃度為1.5 mmol/L。

圖2 不同Mg2+濃度的電泳圖譜

2.3 dNTP用量對ISSR的影響

dNTP是ISSR-PCR擴增的原料，其濃度直接影響PCR擴增產物的生成，當PCR反應在Mg2+濃度為1.5 mmol/L時隨著dNTP濃度的增大，PCR反應增強，特別是較大片段PCR產物反映更為明顯。但隨著dNTP濃度的繼續增大，PCR反應抑制，擴增條帶亮度減弱、條帶數減少。由圖3可知，dNTP濃度低于0.08 mmol/L時，擴增產物背景模糊且大片段擴增產物出現模糊現象；而高于0.16 mmol/L時，出現明顯條帶缺失現象。因此冬蟲夏草ISSRPCR反應體系中最佳 dNTP濃度為 0.08～0.16 mmol/L。

2.4 Taq DNA聚合酶用量對ISSR-PCR的影響

圖3 不同dNTP濃度的電泳圖譜

在ISSR-PCR反應體系中Taq酶是重要的因子，它的種類、活性與用量關系到擴增反應能否正常進行。由圖4可知，當Taq酶用量為0.5 U時，獲得了良好的擴增效果；當Taq酶量大于0.5 U時，擴增條帶產物減少且開始出現彌散現象。可知隨著酶量的增加，PCR擴增效果降低，這與一些文獻報道相同[11]。考慮綜合成本，本研究在25μL反應體系中選擇每個反應0.5 U的酶量作為冬蟲夏草ISSR反應的最佳酶用量。

圖4 不同酶用量的電泳圖譜

2.5 引物濃度對ISSR的影響

引物濃度的高低在PCR反應中也是重要的影響因素。如圖5所示：1～18泳道均有擴增產物，但當引物濃度小于0.8μmol/L時，只有兩條主帶；引物濃度在0.8～1.0μmol/L時，條帶最清晰穩定；大于1μmol/L時，擴增產物逐漸減少，譜帶不清晰且有彌散現象。故冬蟲夏草ISSR-PCR最佳引物濃度以0.8～1.0μmol/L為宜。

圖5 不同引物濃度的電泳圖譜

2.6 模板DNA用量對ISSR-PCR的影響

良好的模板質量和濃度是保證PCR特異性擴增的前提。由圖6可知，模板用量為15～20 ng時，均能產生清晰擴增條帶，而20 ng時譜帶更清晰，模板量在30～50 ng時，隨著模板量的增加，擴增的譜帶亮度反而減弱，只有少量主帶較亮。因此在冬蟲夏草ISSR-PCR反應中，DNA最佳用量為20 ng。

圖6 不同模板用量的電泳圖譜

2.7 退火溫度對ISSR-PCR的影響

運用Biometra公司的梯度PCR儀進行擴增，圖7為835號引物進行的退火溫度梯度試驗。從圖7中可知當退火溫度在49.6～52.0℃之間時擴增條帶清晰、穩定。低于或高于此范圍都將不出帶或出現弱帶現象。因此試驗中835號引物最佳退火溫度選擇為50.8℃。

圖7 835號ISSR引物不同退火溫度電泳圖譜

3 討論

ISSR-PCR擴增中DNA模板的質量是決定擴增效果的重要因素，在一定范圍內隨著模板量的增加，PCR擴增的條帶數隨之增加；但隨著模板量的繼續增加，擴增條帶數減少即小片段產物減少，非特異性增強。為保證有較好的特異性，引物與模板的結合程度和結合量也要保持適當的比例。試驗得出在模板量不變的條件下，引物濃度低時有利于大片段的擴增，引物濃度高時則更有利于小片段的擴增。

Mg2+對擴增結果也起到重要的影響。Taq DNA聚合酶的活性離不開Mg2+，Mg2+通過影響酶進而影響PCR結果。Mg2+濃度過低時酶的活性得不到提高，過高時酶的活性又會受到抑制。同時由于溶解DNA的緩沖液TE中含有EDTA，會螯合Mg2+；加上dNTP中的磷酸基團能和Mg2+結合，使反應體系中Mg2+的實際濃度降低，進而降低Mg2+濃度以致影響酶活性。

試驗得出，引物的退火溫度對PCR擴增結果有明顯的影響。不同的引物具有不同的最適退火溫度，需要進行逐一篩選以獲得較為穩定的標記結果。在運用的10條引物中各引物的退火溫度表現出了相同的趨勢即退火溫度低于或高于最適退火溫度時都會出現缺帶或弱帶的現象。

4 結論

在反應體系中各組分的含量和擴增條件的選擇都會對試驗結果造成影響。在建立反應體系時為了得到可靠的、穩定的、重復性好的擴增結果，同時從經濟角度考慮，在得到相同試驗結果的條件下，應選擇藥品用量少的反應體系組成。最后，本試驗確立了冬蟲夏草ISSR-PCR反應25μL體系為：10×PCR Buffer 2.5μL；模板DNA 20 ng；ISSR 引物0.9μmol/L；dNTP 0.12 mmol/L；Mg2+1.5 mmol/L；Taq DNA 聚合酶0.5 U。

[1]孫愛紅，左雪枝.冬蟲夏草研究進展 [J].安徽農業科學，2007，35（27）：8521-8522，8598.

[2]Artjariyasripong S,Mitchell J I,Hywel-Jones N L,et al.Relationship of the genus Cordyceps and related genera,based on parsimony and spectral analysis of partial 18Sand 28Sribosomal gene sequences[J].Mycoscience,2001,42（6）:503-517.

[3]Nikoh N,Fukatsu T.Interkingdom host jumping underground:phylogenetic analysis of entomoparasistic fungi of the genus Cordyceps[J].Molecular Biology and Evolution,2000,17（4）:629-638.

[4]陳永久，宿 兵，王 文，等.用RAPD標記分析冬蟲夏草（Cordyceps sinensis[Berk.]Sacc）個體的遺傳特性[A].中國菌物學會蟲生真菌專業委員會，中國科學院微生物研究所真菌地衣系統學開放實驗室.中國蟲生真菌研究與應用 [C].北京：中國農業科學技術出版社，1997.97-101.

[5]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[6]Brantestam A K,BothmerR V,Dayteg D.Zntersimple sequence repeat analysis of genetic diversity and relationshipsin cultivated barely of Nordic and Balticorigin[J].Hereditas,2004,144:186-192.

[7]陳永久，王 文，楊躍雄，等.冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）的隨機擴增多態DNA及其遺傳分化[J].遺傳學報，1997，24（5）：410-416.

[8]王 瑜，袁慶華.紫花苜蓿ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草地學報，2007，15（3）：212-215.

[9]范 彥，曾 兵，張新全，等.中國野生鴨茅遺傳多樣性的ISSR研究[J].草業學報，2006，15（5）：103-108.

[10]任軍方，唐龍祥.檳榔基因組DNA提取及ISSR反應體系的優化[J].湖南農業科學，2010，（5）：1-4.

[11]彭 海，張 靜，李曉斐，等.引物濃度與退火溫度對ISSR擴增片段大小的選擇性[J].安徽農業科學，2007，35（17）：5089-5090.