含油廢水中一株高效油脂降解菌的篩選和鑒定

游游，朱琳，張艷，張游2,，唐學璽，肖慧*

1. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島266071

隨著我國經濟的迅速發展，油脂加工廠以及餐飲業排出的油脂廢水量日益增多。直接排放的油脂廢水會飄浮于水體表面，影響水體的復氧及其自然凈化過程，危害水生生態系統，嚴重污染周圍環境[1-2]。

目前，油脂廢水的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法和化學法由于投資大，占地廣，流程復雜，且容易產生二次污染，實際應用較少[3]。而生物法處理油脂廢水，主要利用油脂廢水中的微生物具有一定的油脂降解能力，能將油脂作為碳源和能源，并通過微生物生長過程中產生的脂肪酶等降解酶系的作用將油脂水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為水和二氧化碳等代謝產物[4-5]；整個處理過程投資小，成本低，效率高且無二次污染，現已成為國內外研究的熱點[6-8]。

我國對油脂廢水的生物處理主要采用活性污泥法，然而傳統使用的活性污泥對含油廢水的直接處理能力較低、效果差[9]。因此從自然環境中篩選高效油脂降解菌，采用投菌法對活性污泥加以改善，對處理油脂廢水具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自中國海洋大學魚山校區快餐廳后下水道。

1.1.2 培養基

富集培養液： NaCl 0.5 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏0.5 g，豆油按周期加入，pH 7.0～7.5，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

中性紅培養基：牛肉膏蛋白胨培養基加豆油10 mL，0.6%中性紅水溶液1 mL。121 ℃滅菌20 min。

選擇培養液：蛋白胨1.0 g，NH4NO30.2 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，豆油1.0 mL，pH 7.2～7.4，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 馴化

將采集到的樣品用無菌水 10倍稀釋后充分混合，制成樣液。取5 mL樣液到45 mL富集培養液中，30 ℃，140 r·min-1條件下震蕩培養，并同時做3個平行樣。每2 d觀察，若油脂降解效果好則適量補加豆油。每6 d為1周期，接種10 mL菌液到40 mL新培養液中以促進菌株的生長，馴化持續5個周期。初始加油量隨周期逐次遞增，分別為0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 mL·L-1。

1.2.2 油脂降解菌的分離

從馴化樣中選取油脂分解較充分的菌液，以最佳稀釋濃度 10-5稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養基上，30 ℃培養48 h。挑選不同形態特征的菌落，劃線純化培養。

1.2.3 油脂降解菌的篩選

將純化后的菌株接種于中性紅培養基上，觀察菌落周圍是否變紅，若變紅則表明菌株能夠分解油脂產生脂肪酸[10]。將初篩入選的菌株接種到以豆油為唯一碳源的選擇培養液中，30 ℃，140 r·min-1條件下培養 72 h，用紫外分光光度法[11]測定樣品在225 nm波長下的吸光度值，同時以豆油為溶質石油醚為溶劑，測定不同豆油濃度的吸光度值，繪制標準曲線，根據標準曲線計算含油量以及各菌株的油脂降解率，選取降解率最高的菌株作進一步研究。

1.2.4 降解特性初步研究

從入選的菌種中挑取一環新鮮斜面種子，接種到不同初始 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的選擇培養液中，140 r·min-1條件下培養72 h，測定油脂降解率，獲得最適降解pH值。同理，設定不同培養溫度：17、22、27、32、37、42 ℃，在最適pH值、140 r·min-1條件下培養72 h，獲得最適降解溫度，以及該條件下最佳降解率。

1.2.5 菌落形態觀察及生理生化特性研究

在牛肉膏蛋白胨培養基上觀察入選菌株的菌落特征，并對菌株進行一系列常規的生理生化實驗[12][13]，初步確定菌株的分類地位。

1.2.6 16S rDNA基因擴增及序列分析

采用CTAB法[14]提取細菌總DNA。利用細菌16S rDNA擴增通用引物27F和1492R進行PCR擴增。25μL反應體系中含有：10×PCR緩沖液2.5 μL，1.5 mmol·L-1MgCl21.5 μL，4×dNTP混合物2 μL，引物各1 μL，2.5 U·μL-1的Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 1 μL，加無菌雙蒸水補至25 μL。PCR反應條件為：96 ℃預變性6 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環后72 ℃溫育6 min。

擴增后的16S rDNA純化后由上海桑尼生物公司測序，測得的序列提交到GenBank并在國際生物技術信息網中心（NCBI）數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行序列同源性分析，使用ClustalX1.8軟件與從GenBank數據庫中獲得的16S rDNA序列進行多序列比較，Mega3.0軟件中NJ法（鄰接法）構建 16S rDNA 系統發育樹，bootstrap檢驗，重復1000次，確定該菌的分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株分離及篩選

從中國海洋大學魚山校區快餐廳下水道采集到的樣液中經1個月富集馴化共分離得到12株細菌，編號 ss-1~ss-12。分離得到的菌株經中性紅培養基培養，發現其中9株細菌菌落周圍明顯變紅，初步斷定這9株菌能夠分解油脂產生脂肪酸，具有一定油脂降解能力。

將初篩獲得的菌株接種到選擇培養液中培養72 h后，測定含油量，計算油脂降解率。獲得的標準曲線如圖1，得到回歸方程：Y= 0.5066x + 0.0007，R2= 0.9999；各菌株的油脂降解率如圖2所示。

從圖2可以看出菌株ss-11的油脂降解率最高，達到47.29%，因此選取該菌株做進一步研究。

2.2 菌株降解條件研究結果

2.2.1 最適降解pH值

相同溫度下，培養基的初始pH值對細菌的生長繁殖具有很大影響，每種細菌都有適合生長的最適pH，且只能在一定pH條件下生長繁殖。菌株ss-11在不同pH的選擇培養液中培養72 h后對油脂的降解率如圖3所示。圖3表明：pH值能顯著影響菌株ss-11對油脂的降解率，菌株在pH為5.0~9.0范圍內均能降解油脂。當pH值為7.0~8.0時菌株對油脂的降解率較高，幾乎達50%，pH過高過低，降解率都會降低，當pH為5.0時，降解率不足20%。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

圖2 各菌株的油脂降解率Fig.2 Oil-degrading rate of various strains

圖3 初始pH對降解率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on degradation rate

2.2.1 最適降解溫度

溫度影響著微生物體內一系列生物化學反應，它對生物有機體的影響表現在兩個方面：一方面，隨著溫度的上升，細胞中的生物化學反應速率和生長速率加快；另一方面，機體的重要組成如蛋白質、核酸和催化反應的酶等對溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度地破壞。因此，合適的溫度對菌種性能至關重要。菌株ss-11在pH為7.5，不同溫度條件下培養72 h后對油脂的降解率如圖4。圖4表明：溫度對菌株ss-11的油脂降解率影響顯著。在本實驗所設的溫度范圍內，菌株ss-11均能降解油脂；在37.0 ℃時降解率最高，達87.55%。隨著溫度上升或下降，降解率均有較大程度的下降，溫度為當溫度為17.0 ℃，降解率僅為20%。即得出結論：在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉速為140 r·min-1，37 ℃下培養72 h，該菌的油脂降解率達87.55%。

圖4 溫度對降解率的影響Fig.4 Effect of temperature on decomposing rate

2.3 菌落形態及生理生化實驗鑒定結果

菌落光滑呈圓形，較大，濕潤，中間隆起，不透明，灰白色，無核，邊緣整齊。菌株成桿狀，不運動，兼性厭氧，革蘭氏染色陰性。葡萄糖產酸產氣、淀粉水解等實驗結果見表1。

表1 菌株ss-11的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ss-11

根據細菌的菌落形態以及生理生化實驗結果，結合《常見細菌系統鑒定手冊》[12]以及《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版） 中相關描述，可將菌株ss-11鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。

2.4 菌株ss-11的16S rDNA基因序列

以菌株ss-11的DNA為模版，擴增菌株的16S rDNA基因序列，得到長約1500 bp的16S rDNA片段，如圖5所示。擴增片段經測序，測得其長度為1425 bp，其GenBank序列號為GU993916。

圖5 菌株ss-11的16S rDNA片段擴增電泳Fig.5 Electrophoresis of PCR products of 16S rDNA gene of strain ss-11

2.5 系統進化樹分析

將ss-11的序列提交Genbank數據庫，并與數據庫中序列進行Blast比對，其序列與產酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca同源性達99%。選取6株同源性較高的菌株序列，再選取3株Klebsiella的其它菌株序列進行多序列比對，構建系統發育樹，如圖6所示。

圖6 根據16S rDNA基因序列構建的ss-11系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence analysis

由 16S rDNA基因序列比較可知，菌株與 K.oxytoca親緣關系最接近。結合菌落形態觀察及生理生化實驗結果，將菌株 ss-11鑒定為產酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

3 討論

本研究從學校餐飲廢水中經馴化、分離和篩選，獲得1株高效降解豆油的菌株ss-11，在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉速為140 r·min-1，37 ℃下培養72 h，該菌的油脂降解率達87.55%。經過細菌形態學、生理生化實驗和16S rDNA測序以及系統進化樹分析，將該菌鑒定為產酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

目前，已報道的降解油脂的細菌主要有假單孢菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、節桿菌屬（Arthrobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、硫桿菌屬（Thiobacillus）和硝化桿菌屬（Nitrobacter）等[1,15,16]，其中降解豆油的菌株主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）[17]及淺白隱球酵母（Cyrptococeus albidu）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）[18]。尚未發現關于產酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）降解豆油的報道。此外，該菌可以在pH 6~10、溫度10~45 ℃范圍內生長，對外界環境具有很強的抵抗能力；且已報道的油脂降解菌大多為好氧菌[1]，而產酸克雷伯氏菌（K. ooxytca）屬于兼性厭氧菌，對氧沒有強制性需求，適應環境廣泛，這對于在缺氧等不利條件下油脂的降解十分有益。

本文篩選的油脂降解菌是從自然環境中獲取，通過實驗室的培養、篩選和馴化得到的，通過對其16S rDNA序列分析確定其分類地位并掌握該菌的生物學特性。今后對于該菌的研究可集中在對其進行遺傳改造，探討不同油脂降解菌間的相互作用等方面，提高油脂降解率，以其應用于油脂廢水的生物處理。

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