鹽酸吡格列酮片含量測定方法學的研究

莊文斌 曾晨笛 楊愛群 肖文豪 陳吉生

鹽酸吡格列酮是目前最新的噻唑烷二酮類藥物，近年來，隨著越來越多人對鹽酸吡格列酮的研究，其制劑開發、含量測定方法學也逐漸有報道，但由于中國藥典2005版和2010版，均無收錄鹽酸吡格列酮，查閱文獻，關于鹽酸吡格列酮片含量測定方法，采用流動相的有機相大多數為乙腈，由于乙腈價格昂貴、對人體的毒性較大［1］。為有效控制其質量標準，本文通過方法學摸索，開發出簡單、快速、經濟、低毒及靈敏度高的測定鹽酸吡格列酮片含量的方法，為進一步開發鹽酸吡格列酮新的制劑提供質量控制參考。

1 儀器與試劑

儀器:Waters高效液相色譜系統(沃特Water科技上海有限公司):1525泵，2487可變波長紫外檢測器，Breeze色譜工作站。鹽酸吡格列酮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100634－200401);鹽酸吡格列酮片(15 mg/片，日本武田藥品工業株式會社，分裝批號:070401;081101;090101);試劑:甲醇為色譜純;乙醇、氨水均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的摸索和確定 參考文獻所記載的鹽酸吡格列酮的測定方法［2］，通過對流動相品種、流動相配比、流速、最大檢測波長、pH值等進行摸索，根據峰形、峰面積等指標確定的色譜條件為:色譜柱:Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm);流動相:甲醇:水(80:20)，用新配置的氨試液將pH值調至7.0;流速:1.0 ml/min;紫外檢測波長:224 nm;柱溫:室溫;進樣量20 l。色譜圖見圖1。

2.2 方法學的驗證

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱取相當于10 mg的鹽酸吡格列酮對照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.1 mg/ml的溶液。分別精密量取該溶液10 ml、8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，搖勻。按“2.1”項的色譜條件，分別進樣三次測定。測得各濃度對應的峰面積，以鹽酸吡格列酮的峰面積(A)對濃度(c)進行線性回歸，結果表明，鹽酸吡格列酮在10～100μg/ml濃度范圍內與峰面積線性關系良好。回歸方程為:A=5e+7c+42096;R2=0.9995。

圖1 鹽酸吡格列酮色譜圖

2.2.2 穩定性試驗 參考中華人民共和國藥典穩定性實驗的指導原則［3］精密稱取約相當于5 mg的鹽酸吡格列酮對照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.05 mg/ml的溶液。在本實驗條件下分別在室溫放置不同時間(0、1、2、4、6、24 h)，按“2.1”項的色譜條件，分別進樣三次測定，測得各時間點對應的鹽酸吡格列酮峰面積，計算RSD=0.96%，表明鹽酸吡格列酮的乙醇溶液在24 h內基本穩定。

2.2.3 精密度的考察 精密稱取約相當于5 mg的鹽酸吡格列酮，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.05 mg/ml的溶液。在“2.1”項的色譜條件下連續進樣6次測定，其峰面積的RSD=0.36%(n=6)。

2.2.4 靈敏度-最低檢測限的考察 按照“2.1”項的色譜條件，取溶解鹽酸吡格列酮的乙醇溶液，進樣20 l三次，作為空白溶液色譜圖，根據樣品出峰時間，取樣品出峰附近的一段基線來計算燥聲，測得基線噪音為1957，再配制濃度約為0.01 mg/ml鹽酸吡格列酮樣品溶液。分別精密量取該溶液8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，按“2.1”項的色譜條件，分別進樣三次測定，記錄出峰處信號值，見圖12，在上述色譜條件下，以S/N=3計算得鹽酸吡格列酮的最低檢測限為0.08μg。

2.2.5 回收率試驗 取已知含量的鹽酸吡格列酮片20片，精密稱定，研成細粉并混勻后，分別精密稱取約相當于鹽酸吡格列酮4、5、6 mg，各置200 ml量瓶中，精密加入鹽酸吡格列酮對照品5 mg，加溶劑溶解并定容，搖勻，作為回收率測定用溶液，按“2.1”項的色譜條件，分別進樣三次測定，記錄峰面積。由公式:回收率=(測得量-樣品中含量)/標準品加入量，計算出回收率。

圖2 鹽酸吡格列酮在最低檢測限濃度下的出峰情況

表1 鹽酸吡格列酮的回收率

2.3 樣品測定 取鹽酸吡格列酮片20片，精密稱定，研成細粉取細粉適量(相當于鹽酸吡格列酮5 mg)，精密稱定，置100 ml量瓶中，用乙醇溶解，超聲5 min使溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，制成每1 ml中約含鹽酸吡格列酮0.05 mg的溶液。按“2.1”項的色譜條件，測定本品三批，分別進樣三次測定，記錄峰面積，再根據標準曲線計算含量，結果如下:

表2 3個批次的鹽酸吡格列酮片的含量

3 討論

3.1 采用HPLC法測定鹽酸吡格列酮片的含量，最首要的是選擇合適的色譜條件和測定方法，作為HPLC的流動相，如果選擇粘度較高的溶劑，會在分析時產生很高的壓力，導致柱子的損壞加快。在有機溶劑與水混合的時候，根據混合比例的不同，所產生的粘度(=壓力)的比例也會不同。在實驗中發現，當甲醇與水的比例為50:50時，會產生很高的柱壓，通過調節比例得出，甲醇與水的比例往兩級增大，柱壓會下降。在洗脫能力上，乙腈比甲醇的洗脫能力強［4］，因此使用甲醇代替乙腈時，需要增大甲醇的比例，每次將甲醇的比例增加5%，再選擇哪個比例可以到分離要求，試驗結果顯示，當甲醇:水=80:20時，鹽酸吡格列酮片峰形及出峰時間合適，因此確定流動相的比例為甲醇:水=80:20，驗證結果表明，該流動相適合用于鹽酸吡格列酮片的含量測定。

3.2 應用HPLC法進行分析測定時，常常采用離子抑制法即向含水流動相中加入弱酸、弱堿或者緩沖溶液等改性劑，以使流動相的pH值控制一定數值，抑制溶質的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，以提高分離的選擇性［5］。

3.3 通過驗證實驗確認，本文所用的鹽酸吡格列酮含量測定方法學各項目均達到要求，且本測定方法簡便，片劑不需提取分離，直接溶解過濾即可直接進樣，測定時間短，只需8 min即可完成測定，流動相簡單、毒性低、價格便宜，方法準確、重現性好、精密度高，具有較好的推廣應用價值。

［1］錢伯章．全球乙腈生產緊缺．合成纖維，2009，06:53．

［2］朱鵬祥，錢南萍，魏潤新，等．鹽酸吡格列酮片的HPLC含量測定方法．江蘇藥學與臨床研究，2004，12(6):15-16．

［3］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典2005年版第二部．化學工業出版社，2005，附錄:172．

［4］高效液相(HPLC)流動相乙腈與甲醇的區別，生物信息網，實驗室安全專欄，http://www．biowww．com．cn/shiyan/safe/1970．html．

［5］宋永康，郭嘉，潘葳．影響測定反相高效液相色譜流動相pH值的因素．現代科學儀器，2005，1:95-97．