子宮內膜異位癥在位和異位內膜組織蛋白酶D的研究

金海燕 周龍書 黃丕英

具有活性的子宮內膜組織出現在子宮內膜以外部位時稱為子宮內膜異位癥(endometriosis，EMT，簡稱內異癥)。經典的子宮內膜種植學說提出，經血中所含的子宮內膜碎片可隨經血逆流，經輸卵管進入腹腔，種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，并在該處繼續生長和蔓延，形成內異癥。逆流入盆腔的內膜細胞與腹膜粘附后，必須降解細胞外基質才能植入腹膜［1］。組織蛋白酶D能降解細胞外基質、糖蛋白及細胞連接，從而促進細胞侵襲，與乳腺癌和子宮內膜癌的生長和轉移密切相關［2，3］。內異癥具有侵襲性強，種植生長、遠處轉移和易復發等類似惡性腫瘤的特點，被稱為是一種“良性癌癥”，其發生學上的子宮內膜種植學說與腫瘤細胞的播散很相似［4］。因此，本研究測定組織蛋白酶D在正常子宮內膜、內異癥在位及異位內膜中的表達，以探討組織蛋白酶D在內異癥發病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 卵巢子宮內膜異位囊腫囊壁、內異癥在位子宮內膜取自11例育齡婦女，除子宮內膜異位癥外，無其他內、外科疾病。術前3個月內未使用內異癥治療藥物、性激素類藥物或放置宮內節育器。其中內異癥在位子宮內膜增殖期6例，分泌期5例。

1.1.2 正常子宮內膜 取自月經周期規律的育齡婦女，有正常妊娠生育史，末次月經時間記憶準確，因盆腔良性疾病行子宮切除術的非內異癥患者。術前3個月內未使用性激素類藥物或放置宮內節育器，無其他內、外科疾病。術后經病理學檢查子宮內膜未發現病理學改變。其中增殖期11例，分泌期10例。

1.2 免疫組織化學方法 標本行石蠟包埋，切片經微波爐抗原修復20 min后用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶(SP)法進行染色。采用DAB同步浸染顯色法［5］使所有切片顯色時間相同。實驗設陽性對照及陰性對照。兔抗人組織蛋白酶D為Zymed Biotech產品，S-P免疫組化通用試劑盒為Maxin Biotech產品，均為即用型。

1.3 圖像分析 用陽性單位(positive unit，PU)定量表達免疫組化陽性反應程度。將排除了切片本底因素后的純免疫組化反應程度按灰度圖像分為0到100個等級，每一個等級定義為1個PU。PU值大小與陽性反應程度成正比。在Leica Q550 IW圖像分析系統上測試在位和異位子宮內膜腺上皮的灰度值 Gα和背景的灰度值 Gβ，按公式PU=［(Gα-Gβ)/Gmax］×100計算PU值。Gmax為檢測儀器的最大灰度，等于256。每張染色片隨機測試10個視場［6］。

1.4 統計學分析 用SPSS 10.0醫學統計軟件進行統計學分析。內異癥在位子宮內膜和正常子宮內膜腺上皮之間的比較采用單因素方差分析，卵巢子宮內膜異位囊腫異位腺上皮和同組患者在位子宮內膜腺上皮之間的比較采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 正常子宮內膜和內異癥在位子宮內膜組織蛋白酶D的表達 組織蛋白酶D主要表達于子宮內膜的腺上皮細胞和腔面上皮細胞，分散于間質細胞，陽性產物主要位于胞漿內。正常子宮內膜和內異癥在位內膜腺上皮的組織蛋白酶D存在明顯的周期性變化，分泌期明顯高于增殖期(P＜0.05)(圖1，圖2)。但內異癥在位內膜腺上皮組織蛋白酶D的含量與同期正常子宮內膜比較，差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 正常子宮內膜和內異癥在位內膜腺上皮組織蛋白酶D的含量(PU，±s)

表1 正常子宮內膜和內異癥在位內膜腺上皮組織蛋白酶D的含量(PU，±s)

注:與組1相比較，aP＜0.01;bP=0.90;與組4相比較，dP＜0.01;cP=0.50

組別 例數 組織蛋白酶D正常增殖期子宮內膜111 16.44±1.56正常分泌期子宮內膜 2 10 19.93±2.42ac內異癥在位增殖期子宮內膜 3 6 16.54±2.20bd內異癥在位分泌期子宮內膜4520.50±1.81

2.2 內異癥異位內膜組織蛋白酶D的表達卵巢子宮內膜異位囊腫中異位內膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(PU=22.62 2.34)(圖3)，與同組患者的在位內膜(PU=18.53 2.31)相比顯著升高(P＜0.05)。

圖1 內異癥在位增殖期子宮內膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(×100)圖2 內異癥在位分泌期子宮內膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(×100)圖3 卵巢子宮內膜異位囊腫異位腺上皮組織蛋白酶D的表達(×250)

3 討論

子宮內膜與腹膜建立接觸并進一步侵犯腹膜的機制是認識內膜細胞異位種植的重要分子基礎。內異癥患者的腹腔液中Ⅲ型膠原碎片增加，進一步說明內異癥侵犯細胞外基質而降解細胞外基質成分的蛋白酶活性增強［7］。組織蛋白酶D是天門冬氨酸蛋白酶類的一種，屬酸性蛋白酶，也是一種溶酶體酶，廣泛存在于不同的組織細胞和腫瘤細胞，能催化降解細胞外基質、糖蛋白及細胞連接，從而促進細胞侵襲。它是酸性環境中癌細胞分泌最多的蛋白水解酶，與許多腫瘤侵襲和轉移密切相關。有研究證實其活性與乳腺癌的生長和轉移有關［2］。組織蛋白酶D的濃度與子宮內膜癌侵襲深度呈正相關，與其分化程度呈負相關［3］。

本研究結果顯示，組織蛋白酶D也表達于子宮內膜的腺上皮細胞，內異癥在位內膜腺上皮組織蛋白酶D的表達與正常子宮內膜無明顯差異，但內異癥異位腺上皮組織蛋白酶D的含量卻顯著高于內異癥的在位內膜。文獻報道，內異癥患者的腹腔液中組織蛋白酶D含量也明顯增加［8］。組織蛋白酶D具有破壞宿主間質天然屏障的作用，異位子宮內膜腺上皮細胞通過組織蛋白酶D的高表達，使異位內膜具有很強的蛋白水解能力，能夠降解異位內膜周圍的基底膜及其他細胞外基質成分，破壞腹膜基質細胞的連接，進而侵犯腹膜及病灶周圍的結締組織，使異位內膜在腹膜內種植生長并使病灶不斷擴大。

［1］Kim HO，Yang KM，Kang IS，et al.Expression of CD44s，vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase-2 and Ki-67 in peritoneal，rectovaginal and ovarian endometriosis．J Reprod Med，2007，52(3):207-213．

［2］Ohri SS，Vashishta A，Proctor M，et al．The propeptide of cathepsin D increases proliferation，invasion and metastasis of breast cancer cells．Int J Oncol，2008，32(2)，491-498．

［3］Bradley WH，Lima PH，Rodgers L，et al．Endometrial carcinoma expresses an increased cathepsin B/D ratio．Gynecol Oncol，2008，108(1)，84-89．

［4］Quinn M．Endometriosis:the elusive epiphenomenon．J Obstet Gynaecol，2009，29(7):590-593．

［5］廖劍輝．DAB同步浸染顯色法在免疫組織化學中的應用．暨南大學學報，1996，17:55-56．

［6］申洪．免疫組織化學染色定量方法研究(Ⅲ)．中國組織化學與細胞化學雜志，1995，4(1):89-92．

［7］Pitsos M，Kanakas N．The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of endometriosis． Reprod Sci，2009，16 (8):717-726．

［8］Hudelist G，Keckstein J，Wright JT．The migrating adenomyoma:past views on the etiology of adenomyosis and endometriosis．Fertil Steril，2009，92(5):1536-1543．