毛細管電泳法測量清熱化毒丸中鹽酸小檗堿的含量

王維庭 房娟娟 閆濱

清熱化毒丸由連翹、青黛、黃連、大黃、菊花等15味藥物組成，具有清火化毒，消腫止痛的作用。用于小兒身熱煩躁，咽喉腫痛，口舌生瘡，皮膚瘡癤口臭便秘，疹后余毒未盡等癥狀。鹽酸小糪堿是清熱化毒丸中主要活性成分之一，以抗菌消炎為主。

近年來分析小檗堿型生物堿的方法分別有反向高效液相色譜法［1］，離子交換色譜法［2］，膠束色譜法［3］，薄層色譜-熒光分光光度法等。但此樣品成分復雜，且鹽酸小檗堿為季胺類生物堿，堿性強，極性大，往往被色譜柱吸附，影響峰形，對色譜柱造成很大污染，高效毛細管電泳(HPCE)以其高效靈敏、分離速度快、樣品量小、消耗僅微量等優點已越來越多的用于中藥成分分析及測定中。本文通過對清熱化毒丸中鹽酸小糪堿的毛細管電泳條件進行摸索，建立了鹽酸小糪堿含量測定的高效毛細管電泳方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Beckman P/ACE 5500型高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司)，配備UV檢測器，Chemical Station工作站;酸度計Model PHS-2CA(上海大中分析儀器廠);超聲清洗器KQ-500E(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);萬分之一電子天平(METTLER-TOLEDO中國);涂層熔融石英毛細管柱(47 cm×75 m，河北永年光導纖維廠)。

1.2 試劑 鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-200609)購于中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純(天津市廣成化學試劑有限公司)，水為自制重蒸餾水，其他試劑均為分析純。所需清熱化毒丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號:9013395)，購自藥店。

2 含量測定

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成1 mg/ml的對照品溶液，4℃保存備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取清熱化毒丸2丸，剪碎，稱取3.0065 g置于100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重后超聲(功率250 W，頻率30 kHz)處理30 min，放冷，稱定重量，必要時用甲醇補足失重，過濾。濾液自然揮干后用甲醇溶解，轉移至5 ml容量瓶中，加入2 ml緩沖液后用甲醇定容，最后用0.45 μm有機膜過濾備用。

2.2 電泳條件 涂層熔融石英毛細管柱(47 cm×75 m，有效長度為40 cm);檢測波長為200nm，進樣:氮氣壓力(586 KPa)自動進樣5 s，分離電壓為30KV，柱溫25℃，緩沖液體系為60 mmol/L磷酸緩沖溶液-甲醇(65:35)，調節 pH值為3.2。

2.3 線性關系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量分別于10 ml容量瓶中，加入2 ml緩沖溶液，用甲醇定容至刻度得 0.05，006，0.07，008，0.09，0.10 mg/ml的對照品溶液，依次進樣，以對照品濃度為橫坐標對峰面積做回歸分析，得回歸方程為Y=1000000x-8143.9，r=0.9993。結果表明鹽酸小檗堿在0.05～0.10 mg/ml范圍內線性關系良好，(對照品色譜圖見圖1)。

圖1 鹽酸小糪堿毛細管電泳色譜圖

2.4 精密度試驗 取0.1 mg/ml鹽酸小糪堿對照品溶液，在上述電泳條件下，連續進樣5次，以峰面積計算RSD為0.50%，表明在此條件下精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取供試品溶液一份，分別于0，2，4，8，10 h測定樣品的峰面積，求得RSD值為1.29%，實驗表明供試品在10 h內穩定性良好。

2.6 回收率測定 取5份已知含量的供試品溶液，加入適量對照品，按“2.1.2”項下的方法制備，通過HPCE進行測定，結果見表1。

表1 清熱化毒丸中鹽酸小糪堿加樣回收率(g，mg，%)

2.7 樣品含量測定 按“2.1.2”項方法制備供試品溶液3份，在上述電泳條件下，每份進樣兩次取平均值，得鹽酸小檗堿的含量測定結果為0.1357 mg/g(樣品色譜圖見圖2)。

圖2 清熱化毒丸中鹽酸小糪堿毛細管電泳色譜圖

3 討論

3.1 緩沖溶液的選擇 由于鹽酸小檗堿為季胺類生物堿，帶有正電荷，用磷酸氫二鈉做為緩沖液可使其保持帶有正電荷，不同的緩沖液及不同的比例會影響成分之間的分離度。本實驗先后在硼砂-甲醇及磷酸二氫鈉-甲醇不同濃度緩沖體系下進行電泳分離，發現60 mmol/L磷酸二氫鈉-甲醇(65:35)的緩沖體系分離度較高，可達到良好的分離效果。

3.2 pH值的選擇 在毛細管電泳中，電滲流對pH值有較強的依賴性，直接影響待測成分的出峰時間，pH值降低，緩沖液呈酸性時，電滲流減弱，成分出峰時間延后，pH值升高，緩沖液偏堿性時，電滲流增強，成分出峰時間提前。并且離子的電泳淌度跟有效電荷成正比，極易受緩沖溶液pH值影響，因此緩沖溶液的pH值調節與控制是優化分離的重要對策。同時緩沖溶液的pH值也會影響離子的有效電荷，從而間接影響分離效果。在硼砂-甲醇(85:15)緩沖體系(pH=9.0)中，樣品的出峰時間短，但未能達到基線分離。本實驗又分別考察了磷酸二氫鈉緩沖體系(pH值分別為3.0、4.0、5.0)對分離效果的影響。結果表明，pH值為3.0時有良好的分離效果。

3.3 分離電壓的選擇 本試驗考察了電壓為15 KV～30 KV時的影響。結果表明:電壓低時，基線穩定，但樣品的分析時間延長，峰形變寬;隨著電壓的增加，樣品的遷移時間縮短，峰型窄，分離效果好，但基線噪音有所增大。基于對遷移時間和基線的綜合考慮，本試驗最終選用30 KV作為分離電壓。

3.4 毛細管有效柱長的選擇 熔融石英毛細管柱長是改變出峰時間的主要因素之一，一般目標成分的出峰時間控制在15 min以內為宜。本實驗考察了有效長度為40 cm、50 cm、60 cm的毛細管對出峰時間的影響，結果表明，三者對于目標組分均有良好的色譜峰形和分離度，但40 cm柱長出峰時間在5 min左右，較為快速，因此優先選擇40 cm柱長毛細管。

綜上所述，在目前分析黃連藥材及其復方制劑的較常用的含量測定方法中，高效液相色譜法應用最為廣泛，薄層層析方法已經較為少見。高效液相色譜法分離具有重現性好，分離效果穩定、靈敏度高的優點，但是由于小糪堿是季胺堿，堿性強，極性強，易離子化，且易使液相色譜柱中的ODS染色，需要大量溶劑沖洗且耗時較多，而且由于黃連中含多種季胺堿，極性類似，液相色譜不易將其分開，相互之間易造成干擾。HPCE的區帶電泳模式，由于使用熔融石英毛細管空管，不怕污染和堵塞，易清洗，且有分離效率高，樣品需要量極少的特點，僅使用簡單少量的緩沖液，幾乎不產生廢液，分析耗費低，樣品預處理簡單，幾乎可稱為綠色分析方法，尤其適合于基質比較復雜，結構近似的藥用植物成分的分析。在本實驗中，可同時分離黃連中的7個季胺生物堿，專屬性和分離度良好，可用于該類成分的指紋圖譜研究。HPCE既可結合質譜技術建立復方藥物指紋圖譜，又可進行多種有效成分或指標成分定量，還可用于體內藥物分析，開展有效成分研究。HPCE分離分析藥用植物成分的發展具有極為廣闊的前景。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)．北京:化學工版社，2005:705．

［2］文欣欣，劉丹華，余陳歡，等．薄層色譜-熒光分光光度法測定黃連及香連丸中鹽酸小檗堿的含量．中國中醫藥信息雜志，2008，15(10):54．

［3］余為，胡薏冰．高效毛細管電泳法測定紫黃止血消炎粉中鹽酸小檗堿的含量．中國實用醫藥，2008，3(15):73．