紅樹林放線菌的篩選與抗真菌和抗腫瘤活性的測定

李蓉, 張京良, 江曉路＊, 管華詩

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003)

紅樹林放線菌的篩選與抗真菌和抗腫瘤活性的測定

李蓉1,2, 張京良1, 江曉路＊1, 管華詩2

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003)

通過從深圳福田紅樹林根際于不同季節采集的3份土樣和2份水樣中分離得到95株放線菌,94%的放線菌為鏈霉菌屬。測定95株放線菌發酵液對9種病原真菌的抗菌活性,其中31.6%的放線菌發酵液有不同程度的抗病原真菌作用。同時采用MTT法測定了它們對肺癌細胞A549、白血病細胞株K562兩種腫瘤細胞的細胞毒活性,其中21%放線菌發酵液具有細胞毒活性。s33、s62、s65和s68這個4株放線菌發酵液具有抑制5種以上真菌的作用,并且對兩種腫瘤細胞株均有作用。

紅樹林;放線菌;抗真菌活性;抗腫瘤活性

紅樹林是分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落。該地帶的土壤由于處于咸淡水交匯的特殊環境,兼具海洋與陸地的性質,同時又不斷接受紅樹林植物的供養、庇護,蘊藏著極為豐富獨特的微生物資源[1-2]。微生物是紅樹林生態系統的重要組成成分和最主要的分解者,推動著生態系統的物質循環與能量流動[3]。放線菌是原核生物中高G+C含量的革蘭氏陽性細菌類群,在自然界中分布很廣,不僅在自然界物質能量循環中扮演重要的角色,更能夠產生種類繁多的生物活性物質,是一類具有廣泛實際用途和巨大經濟價值的微生物資源。據統計,放線菌源的抗生素占所有抗生素的67%(主要是鏈霉菌52%和稀有放線菌15%)[4]。世界各地的科學工作者相繼從海洋微生物的放線菌中分離獲得具有抗細菌、真菌和抗腫瘤的活性產物和臨床藥物,并已證明這些活性具有相關性[5-6]。生存于紅樹林根際的放線菌,由于紅樹林生態系統的特殊多樣性,因而具有復雜獨特的代謝途徑,其次級代謝產物在結構類型以及生物活性方面都呈現出與陸生放線菌不同的特點和多樣性[7]。因此,從不同的生態環境乃至極端環境篩選新的放線菌菌株是微生物藥物研究的熱點。

作者從深圳福田紅樹林根際和水環境中分離放線菌,并研究其抗真菌和抗腫瘤細胞活性。福田紅樹林保護區位于深圳灣的東北部,屬亞熱帶海洋性季風氣候,年平均相對濕度高達79%[8]。林內各種植物生長茂盛,物質積累豐富,微生物組成復雜而豐富,具有很高的研究價值。

1 材料與方法

1.1 樣品

分別于不同季節分離自深圳福田紅樹林采集的土樣和水樣。土樣采集自5 cm深的根際泥,水樣采集于土壤空隙水。

1.2 供試菌株和腫瘤細胞株

供試菌株為白色假絲酵母(Candida albicans),黑曲霉(Aspergillus niger),圓弧青霉(Penicillium cyclopium),黑根霉(Rhizopusnigricans),辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum),小麥赤霉病菌(Gibberella sanbinetti),黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis),谷子白發病菌(Sclerospora graminicola),以上菌種均由中國海洋大學食品與工程學院微生物實驗室提供。肺癌細胞A549、白血病細胞株K562由中國海洋大學醫藥學院藥理實驗室提供。

1.3 培養基

1)放線菌培養基:改良Gause 1號培養基(NaCl質量濃度為1 g/dL);

2)放線菌發酵培養基(組分g/dL):豆粉1.2,玉米粉1.2,淀粉0.6,K2HPO40.2,NaCl 0.5,p H 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

3)霉菌和酵母菌培養基:PDA培養基(馬鈴薯200 g削皮切絲煮沸20 min,取浸汁,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,p H自然, 115℃滅菌30 min)。

1.4 放線菌分離、初步鑒定與發酵

1.4.1 分離 采用稀釋分離法進行分離,分離于加有0.01%重鉻酸鉀的Gause 1號培養基平板(重鉻酸鉀溶液在Gause 1號培養基融化冷卻后至50℃左右時加入)。置28℃培養5 d后挑取單菌落分離純化。將純化的單菌落接到Gause 1號斜面上培養后,編號置于4℃保存。

1.4.2 初步鑒定 將放線菌用插片法接種在Gause 1號培養基上,28℃培養7～8 d后,取出插片,用光學顯微鏡進行菌體形態觀察[9]。

1.4.3 發酵 活化放線菌至Gause 1號斜面培養, 28℃培養5 d后接種到發酵培養基搖瓶發酵。100 mL三角瓶中裝30 mL發酵培養基,搖床轉速180 r/min,28℃發酵5 d。

1.5 抗腫瘤細胞毒活性的樣品準備

發酵液中加體積比2倍量的丙酮,超聲破碎菌體,離心取上清液,減壓濃縮至不含丙酮,冷凍干燥,得各菌株的發酵提取樣品。精密稱量適量樣品,用80%的甲醇配成1 g/L的樣品溶液,供測試抗腫瘤活性。

1.6 抗菌和抗腫瘤活性測定方法

1.6.1 抗菌活性的測定 在培養皿中分別移入菌濃度為109 cfu/mL的供試菌懸液0.1 mL,移液管取已融化冷卻至45℃的PDA培養基12 mL/平皿,立即混勻。待凝固后,在直徑為6 mm的圓形無菌雙層濾紙片上注入放線菌發酵上清液20μL,放在平板上于28℃培養24～48 h后測定抑菌圈直徑[9]。

1.6.2 抗腫瘤細胞毒活性的測定 腫瘤細胞在37℃、體積分數5%CO2下培養于含有10%胎牛血清的培養液中,約2 d傳代一次。在96孔平底培養板中每孔加入1×105個處于對數生長期的腫瘤細胞。每孔200μL,37℃培養1 h后,每孔加樣品液2μL,繼續于37℃培養24 h[10]。培養結束后在光學顯微鏡下觀察細胞形態變化,判斷有無細胞凋亡或細胞壞死的形態特征,必要時拍照。每孔加預冷的5 g/L的MTT溶液(用PBS溶液配制)各20μL, 37℃孵育4 h,4℃、2 000 r/min離心10 min,吸去上清液,每孔各加150μL DMSO,置酶標儀上充分振蕩,使MTT紫色產物完全溶解,測量每孔570 nm處的OD值。實驗中全部測試樣品均設3個孔,取OD平均值,按下式計算抑制率(IR):

IR=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%

2 實驗結果

2.1 放線菌的分離與初步鑒定

將不同季節采集到的5份樣品進行微生物分離,共分離到形態特征各有差異的放線菌95株,夏季采集樣品中分離的放線菌較冬季樣品多9%。通過初步鑒定發現,其中89株放線菌為鏈霉菌屬,小單孢菌屬5株,諾卡氏菌屬1株。

2.2 放線菌發酵液的抗菌活性

對95株放線菌進行搖瓶發酵,測發酵上清液的抗菌活性。作者選取不同類型的致病性真菌,包括植物致病菌黑曲霉、黑根霉、圓弧青霉、辣椒炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、黃瓜霜霉病菌、谷子白發病菌以及致病性真菌白假絲酵母作為代表性供試菌株進行測定。抑菌圈的直徑大于10 mm則確定為具有抑菌活性。結果表明,31.6%的放線菌的發酵液顯示出單一或多種抗菌活性。由圖1可見,對辣椒炭疽病原菌和黃瓜枯萎病原菌有較好的抑制活性的放線菌的發酵液分別有28.4%和30.5%。同時具有抑制兩種供試菌活性的有20株,同時具有抑制3種供試菌活性的有14株,同時具有抑制4種供試菌活性的有9株,具有抑制5種以上供試菌的活性的放線菌菌株有4株,分別為s33、s62、s65和s68。

圖1 對9種供試真菌菌株有抑菌活性的95株放線菌比例Fig.1 Ratio of antifungal activity strains in 95 actinomyces

2.3 放線菌發酵液細胞毒活性

以肺癌細胞A549、白血病細胞K562為供試腫瘤細胞測定菌株發酵液的細胞毒活性。抑制率大于50%則確定作為具有細胞毒活性。結果顯示, 21%的放線菌的發酵液有抗腫瘤細胞毒活性。同時具有抑制兩種腫瘤細胞株活性的放線菌有6株,分別為s10、s33、s47、s62、s65和s68,結果見表1,2。

3 結 語

深圳福田紅樹林內植物生長茂盛,根部發達,代謝活動旺盛,能釋放較多的糖、氨基酸、維生素及其他可作為微生物營養的物質,從而促進根際微生物的生長繁殖;微生物的代謝活動及其代謝產物又可增加紅樹植物的養分或促進其對養分的吸收和利用,從而有利于植物的生長[11]。所以紅樹林內微生物組成復雜,其中包括大量的放線菌對紅樹林根際生態起到調節作用。

紅樹林根際放線菌在種類和數量上都遠遠比菜園、湖畔、海泥等地所含放線菌豐富和眾多[12]。作者從福田紅樹林分離得到了95株放線菌,包括89株鏈霉菌、5株小單孢菌和1株諾卡氏菌,其中31.6%的放線菌發酵液具有抗病原真菌作用,21%放線菌發酵液具有細胞毒活性。在供測試的9種病原真菌中,對植物致病菌辣椒炭疽病原菌和黃瓜枯萎病原菌抑制率相對較高。s33、s62、s65和s68這4株放線菌的發酵液具有抑制5種以上病原真菌的活性。s10、s33、s47、s62、s65和s68這6株放線菌的發酵液同時對2種腫瘤細胞株均有作用。由結果可知,s33、s62、s65和s68這4株放線菌的發酵液中的次生代謝產物具有較好的應用前景,具有較高的研究價值。有關這4株放線菌的發酵液的分離純化以及這4株菌的生理生化特征正在進行中。

表1 放線菌發酵液對腫瘤細胞株A549的作用Tab.1 Antitumor activity tow ard cell line A549 of fermentation broth of actinomyces

表2 放線菌發酵液對腫瘤細胞株K562的作用Tab.2 Antitumor activity toward cell line k562 of fermentation broth of actinomyces

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(責任編輯:李春麗)

The Antifungal and Antitumor Activities of the Isolated Mangrove Forest Actinomycetes

LI Rong1,2, ZHANGJing-liang1, J IAN G Xiao-lu＊1, GUAN Hua-shi2
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.School of Medicine and Pharmaceutics,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The obective of this study is to isolate mangrove forest derived actinomyces strains for obtaining the bioactive metabolite producing strains to investigate antifungal and anti-tumor active metabolites.For this,actinomyces strains were isolated by single colony isolation technique.The antifungal activity was assayed by paper method.The anti-tumor activity was assayed by MTT method.Ninety-five strains of actinomyces were isolated from 3 soil samples and 2 water samples collected from a mangrove forest in Futian,south of Shenzhen,China,of which 94%were streptomycetaceae.Nine pathogens were used to test the antifungal activity of the ninety-five strains,among of them 31.6%of the fermentation broth showed the antifungal activity.Two tumor cell lines(A549 and K562)were used to test the antitumor activity with the MTT method.The result indicated that 21%of the fermentation broth presented the antitumor activity.Furthermore,the fermentation broth of the s33,s62,s65and s68 showed antifungal activity toward more than five pathogens and antitumor activity on the two cell lines.

mangrove forest,actinomyces,antifungal activity,antitumor activity

R 979.1

:A

1673-1689(2010)01-0094-04

2008-07-01

國家自然科學基金項目(30771646)。

李蓉(1981-),女,湖北荊州人,藥物化學專業博士研究生。

＊通訊作者:江曉路(1958-),山東青島人,理學博士,教授,主要從事應用微生物學方面的研究。Email:jiangxl@ouc.edu.cn