味蕾細胞的Percoll梯度離心純化技術研究

王騰浩, 秦玉梅, 張根華, 鄧少平＊

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

味蕾細胞的Percoll梯度離心純化技術研究

王騰浩1, 秦玉梅1, 張根華2, 鄧少平＊1

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

以ICR小鼠的菌狀味蕾細胞為研究對象,利用Percoll梯度離心技術純化小鼠菌狀味蕾細胞,通過臺盼藍染色和免疫組織化染色方法分別比較純化前后的味蕾細胞存活率與純度的變化,應用透射電鏡從超微結構鑒定味蕾細胞。結果顯示:通過不連續的Percoll密度梯度離心法對味蕾細胞進行純化,細胞分層效果明顯,主要位于體積分數20%與40%的Percoll工作液之間;免疫組化結果表明:純化后味蕾細胞的純度顯著提高,從10%提高到65%(P<0.01),臺盼藍染色結果顯示:純化后細胞活度達94%,電鏡則從超微結構上證實了純化的細胞為味蕾細胞。

味蕾細胞;純化技術;Percoll;超微結構

味蕾是哺乳動物味覺的主要感覺器,主要分布在舌、上軟腭、咽、喉和食道上部[1]。舌上皮中有4種不同空間分布的舌乳頭(lingual papille):絲狀乳頭(filiform papillae,FI)、菌狀乳頭(fungiform papillae,FF)、葉狀乳頭(foliate papillae,FL)和輪廓狀乳頭(circumvallate papillae,CV),其中FF、CV、FL乳頭因含味蕾而被稱為味乳頭(gustatory papillae)[2]。FF乳頭主要位于舌前部三分之二的區域,哺乳動物的每個FF乳頭含一到多個味蕾[3]。每個味蕾有50～150個細胞組成,這些細胞根據其超微結構特征將這些細胞分為4種類型[4]:Ⅰ型細胞(暗細胞)、Ⅱ型細胞(亮細胞)、Ⅲ型細胞(中間細胞)和Ⅳ型細胞(基細胞)。其中Ⅱ型和Ⅲ型細胞被認為是味覺感受細胞,已成為味覺生物學研究的熱點。隨著味蕾細胞分離方法的建立和發展,味蕾細胞的研究已經取得長足的進展。如何獲取大量高純度、高活性的味蕾細胞仍是亟待解決的問題。

味蕾細胞是特化的上皮細胞,對微環境的要求比較嚴格,且細胞在形成之后平均每十天更新一次,而培養的味蕾細胞不具備增殖功能[7],故很難通過細胞培養的方法來獲取大量味蕾細胞。現在味蕾細胞的分離技術相對較少,主要有直接分離法、微吸管吸取法和兩步酶解法[5,6],所分離的細胞在數量和純度上均尚難以滿足對味蕾細胞離體研究的需要。作者通過酶-機械法獲取細胞懸液,使用不連續的Percoll密度梯度離心法分離純化味蕾細胞,通過優化條件建立了一套有效的味蕾細胞分離純化技術,為離體味蕾細胞生理生化特性及味蕾細胞傳感器研究提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周ICR小鼠購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 IMDM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素與鏈霉素均購自Gibco公司;MCDB 153、膠原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)、中性蛋白酶Ⅱ(dispaseⅡ)、胰島素(insulin)均購自Sigma公司;HEPES購自北京鼎國生物技術有限公司、細胞角蛋白(Cytokeratin,CK8)購自Epitomics公司,即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,其他試劑均為分析純。1.1.3 培養基及主要試劑的配制 參考Ozdener等[8]的培養基配置方法,IMDM培養基中添加10% FBS,1:5 MCDB 153,50 ng/mL胰島素和100 U/ mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

Tyrode溶液:NaCl 7.65 g,KCl 0.37 g,CaCl20.89 g,MgCl20.20 g,HEPES 2.38 g,葡萄糖1.80 g,丙酮酸鈉1.10 g,NaHCO30.42 g,p H 7.4。無鈣Tyrode溶液,省略CaCl2。

1.2 方法

1.2.1 味蕾細胞懸液的制備 取6～8周ICR小鼠CO2致死,斷頭后取舌,舌剪至CV狀乳頭邊緣處。Tyrode溶液清洗舌頭表面的血跡,清洗完畢放入無鈣Tyrode溶液中。用5 ml一次性注射器將0.1～0.3 mL的混合酶液(1∶1混合的1 mg/ml膠原酶Ⅱ+3 mg/ml中性蛋白酶Ⅱ)注入舌上皮與其下的肌肉層之間,注射器針頭要一直伸至舌尖邊緣后緩慢地注射酶液至舌腫脹,舌背面和側面少量多次注射酶液。無鈣Tyrode溶液中孵育4～6 min,用眼科鑷將上皮與肌肉層輕輕剝離。將剝離的上皮迅速放入新的Tyrode溶液中,用眼科剪將含有FF乳頭的舌前部1/3區域剪下,置于冰浴中的Tyrode溶液中備用。將含有FF乳頭的上皮切成大約1 mm2的小碎片,放入含有質量分數0.25%胰蛋白酶和0.05%EDTA消化液的培養皿內,37℃、體積分數5%CO2培養箱內消化5～10 min,得細胞懸液。

1.2.2 Percoll離心液梯度分離

1)Percoll工作液的制備 將Percoll母液和Percoll稀釋液按表1所列方案配制Percoll各密度梯度溶液。用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。

2)裝樣 樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。

3)Percoll離心液梯度的選擇 參考Seta等[9]的方法(1997)并對Percoll工作液進行改進,簡要過程為:先通過在50 mL離心管中加入各種濃度的Percoll工作液各3 mL,濃度從高到低鋪于管中,后加入4 mL 1×107～1×108個/mL細胞懸液,觀察細胞主要集中區域,選取細胞分離純化的Percoll梯度濃度。通過實驗選取得出用于純化味蕾細胞的Percoll工作液質量分數為70%、40%和20%。用選取的濃度梯度采用兩次離心法對味蕾細胞進行純化。如圖1為3層不同密度的Pecoll液疊加時的實物圖。從下到上分別為質量分數70%、40%和20%的Percoll溶液。

表1 Percoll工作液配制表Tab.1 Preparation of Percoll solution of different concentration

圖1 不同密度Percoll溶液疊加圖Fig.1 Discontinuous gradients of three Percoll working solution with the concentration of 70%,40% and 20%from top to bottom

4)味蕾細胞的純化 將細胞懸液鋪于上述不連續密度梯度的Pecoll分離液中,在離心管中先靜置30 min,然后25℃下1 200 r/min離心6 min。分離的細胞絕大部分位于在兩層Percoll工作液的交界面時,逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞。收集含有Percoll液的細胞用培養培養液洗滌兩次,計數調整細胞濃度后備用。

1.2.3 ABC免疫組化評估味蕾細胞的純度 制作細胞爬片,體積分數4%多聚甲醛4℃固定60～90 min。室溫1份體積分數30%H2O2與50份純甲醇的混合液中浸泡30 min,以滅活內源性過氧化物酶,蒸餾水1～2次。后按博士德試劑盒說明操作。DAB顯色封片后普通光學顯微鏡下觀察。所使用一抗為兔抗CK8的單克隆抗體,稀釋度1∶500。實驗設陰性對照,一抗用PBS代替。

1.2.4 味蕾細胞的超微結構鑒定 純化的細胞懸液1 000 r/min離心4 min,去上清,將細胞懸浮于體積分數2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜。倒掉固定液,用0.1 mol/L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min,然后用質量分數1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h。倒掉固定液,用0.1 mol/ L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min。用梯度體積分數(50%,70%,80%,90%和95%)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理各15 min,再用100%的乙醇處理一次20 min,最后過度到純丙酮處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=1∶1處理樣品1 h,然后用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=3∶1處理樣品3 h,純包埋劑處理樣品過夜。將經過滲透處理的樣品包埋起來,70℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機中切片,獲得70～90 nm的切片,該切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾的體積分數50%乙醇飽和溶液各染色15 min,用日本J EOL公司的J EM-1230型透射電鏡觀察。

1.2.5 味蕾細胞活力測定 用臺盼藍染色法測定味蕾細胞的活力。將純化前、后的味蕾細胞懸液的密度各調至1×106/mL,取9滴細胞懸液滴入試管,加入1滴質量分數0.4%臺盼藍染色,混勻,滴在計數板上。此時由于死細胞的細胞膜被破壞,細胞被染成紫藍色,而活細胞不被染色。3 min內在顯微鏡下用血細胞計數版分別計數活細胞和死細胞的數量,按下式計算味蕾細胞的存活率。

2 結果與討論

2.1 不同梯度層味蕾細胞形態和活力

實驗采用離心前將細胞懸液在離心管中先靜置30 min,使細胞懸液中的味蕾細胞下沉,以提高分離效果。25℃、1 200 r/min離心6 min,離心后細胞主要集中在各濃度液面交界處,各層內部細胞分布較少。各個細胞聚集層的細胞形態有明顯差異,如圖2所示,原細胞懸液中混有大量雜細胞和上皮碎片(圖2(A),且活性相對較低,計數1 895個細胞,其中413個臺盼然染色陽性,成活率為78.21%,經純化后體積分數20%Percoll溶液與40%Percoll溶液的液面交界處的分離物以梭形細胞為主,混有少量圓形細胞和扁平細胞(圖2(C)),從形態上判斷味蕾細胞主要集中在這一層,將位于此層的細胞清洗重懸再純化,混雜細胞的數量會進一步減少。20%與原液層之間主要為一些內徑在5～10μm且大小均勻的圓形細胞(圖2(B)),最下層的交界面則較多地聚集了一些內徑為20～30μm的細胞(圖2(D)),離心管底部有大塊的上皮碎片。參照表1數據可知小鼠味蕾細胞的密度主要集中在1.03-1.06 g/mL之間,比Seta[10]得出的大鼠的密度要小,并且介于外周非味覺上皮細胞的密度之間。純化后細胞活性有較大提高(計數了2 478個細胞,其中131個臺盼藍著色陽性,成活率為94.71%),主要原因可能是因為純化前含有大量非味覺上皮細胞,這些細胞在分離過程過受損所致。上述結果證明了Percoll梯度離心純化味蕾細胞有利于提高味蕾細胞的活性。

圖2 Percoll離心后各細胞聚集層細胞形態:(A)細胞原液,(B)20%與原液交界面,(C)20%～40%交界面,(D)40%～70%交界面Fig.2 Cell morphology of different layers after Percoll centrifugation:original cell samples(A),interface between 20%Percoll and cell samples(B), interface between 20%and 40%Percoll(C), interface between 40%and 70%Percoll(D)

2.2 ABC免疫組化定量判定味蕾純化前后細胞濃度

味蕾細胞起源于上皮細胞,是一種簡單的柱狀上皮細胞,被周圍的復麟質狀上皮細胞所包圍。有5種CK分子(CK 7、8、18、19和20)在正常的味蕾細胞中表達,但在其周圍的非味覺細胞中不表達。其中CK 8在大量味蕾細胞表達,是一種良好的成熟和正在成熟的味蕾細胞的分子標記[11]。與其他成熟的味蕾細胞的標記(α-gustducin,PLCβ2, NCAM等)相比,CK 8能夠更充分的表明混雜細胞中味蕾細胞的純度。如圖3(A),省略一抗時味蕾細胞沒有陽性反應,以證明此抗體的特異性。從圖3(B)和圖3(C)中可以看出純化后陽性味蕾細胞的數量顯著多于純化前,通過計數得知純化前陽性味蕾細胞數少于10%(8.59±1.29,n=10),而純化后陽性味蕾細胞數量顯著提高(P<0.01),大約占細胞總數65%(65.7±2.11,n=12)。造成純化后味蕾純度不太理想的原因可能因為味蕾細胞分為4種類型,迄今還沒有那種標記物能夠完全標記所有類型味蕾細胞。

圖3 純化前后味蕾細胞的CK8免疫組化。(A)陰性對照,(B)和(C)分別為純化前后味蕾細胞的CK8免疫組化Fig.3 Immunohistochemistry of CK8 for TBCs before(B)and after(C)purification;the negative contrast is showed in(A)

2.3 味蕾細胞超微結構鑒定

圖4 分離味蕾細胞的透射電鏡圖片,(A)橫切面圖, (B)縱切面圖Fig.4 Transverse section(A)and longitudinal section (B)of an iolated taste bud cell by transmission electron microscopy

味蕾細胞的超微結構也是識別味蕾細胞的一個重要標志,每種類型細胞具有獨特的細胞內部結構,純化后細胞的透射電鏡結果如圖4所示,圖4 (A)圖為細胞的橫切面,胞漿中含有豐富的微絲和粗面內質網,細胞核形狀不規則,含有大量的異染色質。細胞質中存在許多100～400 nm的致密團粒結構(如箭頭所示),這是I型細胞的顯著結構特征,I型細胞是暗細胞,呈紡錘形,味蕾中其數量最多。圖4(B)為細胞的縱切面,細胞呈梭形,胞漿透亮,具有圓形細胞核,細胞頂部細胞質不含有致密顆粒,這是II型細胞的特點。細胞純化技術是細胞生物學實驗中的基本技術之一,它主要是根據細胞本身的某些性質來分離具有同一性狀的細胞群。細胞的分離方法有很多種,常用的細胞分離純化方法有:速度沉降分離法;等密度沉降分離法;流式細胞分離儀分離法;免疫磁珠分離法等[12]。與需要抗體的流式細胞分離儀分離法和免疫磁珠分離法相比,Percoll密度梯度離心方法操作簡單方便,成本低,一次處理細胞數量多。Percoll是一種外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅膠顆粒,以它作為密度梯度分離劑的優點是無毒,無刺激性,對細胞無吸附作用,產生的滲透壓很小,在全部密度范圍保持相等張力。Percoll密度梯度離心法主要根據細胞之間密度差異分離細胞。細胞在連續密度梯度的分離介質中,受強離心力的作用,最后會到達與其密度相同的分離介質層面,并能保持平衡。在非連續的梯度中,分離的細胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度交界面上或密度層內。

實驗通過采用Percoll密度梯度離心法對小鼠味蕾細胞進行純化,獲得了較好的效果,純化后的細胞純度在65%以上(P<0.01),而且細胞存活率達到94.71%。細胞經消化后形態趨于圓形,培養后味蕾細胞的形態異于體內形態。為了證明培養的細胞為味蕾細胞,通過透射電鏡技術對其進行鑒定,結果從精細結構上證明了純化的細胞為味蕾細胞。但由于味蕾細胞包含4種類型的細胞,而CK 8不能標記所有味蕾細胞,這也許是導致純化后細胞純度偏低的主要原因。

3 結 語

總之,作者已經初步建立了一種有效的小鼠味蕾細胞分離純化方法,通過Percoll密度梯度離心法從小鼠舌上皮組織中富集形態和活力良好的味蕾細胞。應用純化的味蕾細胞可以開展甜味感受熱力學和細胞傳感器方面的研究,并結合膜片鉗和鈣影像技術研究味蕾細胞的生理生化特性。

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(責任編輯:朱明)

Development of a Discontinuous Percoll Gradient Centrifugation Process for Taste bud Cells Purification

WANG Teng-hao1, QIN Yu-mei1, ZHANG Gen-hua2, DENG Shao-ping＊1
(1.College of Food Science and Biotechnology Engineering,Sensory Science Laboratory,Zhejiang Gongshang Uni
versity,Hangzhou 310035,China;2.College of Food Science and Biotechnology,Changshu Institute of Technolo
gy,Changshu 215500,China)

In this manuscript,the taste bud cells of fungiform papillae of ICR mice were select as research model and Percoll gradient centrifugation was used as purify method.The methods of trypan blue staining and immunohistochemistry staining were performed to compare the viability and purity of taste bud cells of before and after purification respectively.Taste bud cells were further identified by transmission electron microscopy.Results showed that taste bud cells, which were purified by discontinuous Percoll gradient centrifugation,were remarkably separated and mainly located interface between 20%and 40%Percoll working solution;the purity of taste bud cells were distinctly improved from less than 10%to more than 65%(p<0.01)by this treatment;the viability of taste bud cells were up to 94%after purification by trypan blue staining and the results of transmission electron microscopy further confirmed taste bud cells from ultrastructure.

taste bud cells,purification technology,Percoll,ultrastructure

Q 434

:A

1673-1689(2010)01-0118-05

2009-03-03

國家自然科學基金資助項目(30770536);浙江省科技廳新苗人才項目(2008R40G2050028);浙江工商大學研究生科研創新基金(1110XJ1508066).

＊通訊作者:鄧少平(1956-),男,江西新干人,教授,博士生導師,主要從事食品感官科學方面的研究。Email:spdeng@zjgsu.edu.cn