取代度相同的N-酰化低聚殼聚糖清除自由基作用的研究

孫濤, 銀旭紅, 謝晶, 李立, 賴克強, 周冬香

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

取代度相同的N-酰化低聚殼聚糖清除自由基作用的研究

孫濤, 銀旭紅, 謝晶, 李立, 賴克強, 周冬香

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

低聚殼聚糖經N-酰化得到取代度相同的N-馬來酰低聚殼聚糖和N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖,其取代度均為0.25。用紅外光譜對其結構進行表征,凝膠色譜測定其相對分子質量大小。并考察了其對羥基自由基(.OH)和1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)的清除能力。結果表明:取代度相同,N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖對.OH、DPPH的清除能力優于N-馬來酰低聚殼聚糖。這說明取代度相同時,取代基的結構會影響N-酰化低聚殼聚糖對自由基的清除活性。

低聚殼聚糖;N-酰化;抗氧化;取代度

自由基引起的氧化對機體具有巨大的損傷作用,如引起蛋白質損傷、酶失活、導致衰老、腫瘤、動脈硬化等多種疾病[1-2]。因此篩選高效的活性氧清除劑具有重要的意義。低聚殼聚糖是殼聚糖的降解產物,其分子單元結構中有大量的氨基和羥基,具有良好的抗氧化性[3-5],同時也決定了它可以進行多種化學改性。N-酰化改性是低聚殼聚糖的一種重要改性方式,研究報道N-酰化殼聚糖具有良好的吸濕保濕和抑菌作用[6-7],但是其抗氧化性,尤其是其N-取代基結構和取代度與其抗氧化性能之間的關系還尚未見報道。作者通過制備取代度相同的N-馬來酰和N-鄰苯二甲酰化低聚殼聚糖,通過考察其對羥基自由基·OH和DPPH的清除活性,研究了取代基團的結構對N-酰化低聚殼聚糖的抗氧化活性的影響,為低聚殼聚糖衍生物抗氧化性能的進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

低聚殼聚糖,購自浙江金殼生物化學有限公司(凝膠色譜測定其相對分子質量為5 000 000);魯米諾,DPPH,購自Sigma公司;其余試劑均為分析純,購自上海化學試劑公司;磁力攪拌器,p H計,分光光度計,電導率儀,EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀,Waters 515型凝膠色譜儀。

1.2 殼聚糖衍生物的制備

稱取5.0 g低聚殼聚糖加入100.0 mL蒸餾水溶解,攪拌溶解,稱取1.0 g馬來酸酐(0.5 g鄰苯二甲酸酐),用20.0 mL丙酮溶解,然后緩慢加入反應器,在室溫下攪拌反應15 h,然后用丙酮沉淀,過濾,產物用丙酮反復洗滌,最后在60℃烘干,得到N-馬來(鄰苯二甲)酰低聚殼聚糖衍生物[8]。

1.3 結構表征

1.3.1 紅外光譜 紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進行,采用KBr壓片法制樣,測定波數范圍為500～4 000 cm-1,分辨率為0.8 cm-1。

1.3.2 相對分子質量的測定 凝膠色譜法測定N-酰化低聚殼聚糖相對分子質量大小。測試條件如下:柱子:TOSOH BIOSEP TSK-Gel G4000SWXL (D7.8 mm×300 mm);流動相:0.2 mol/L醋酸鈉和醋酸緩沖溶液,p H=4.8;色譜儀:Waters 515型凝膠色譜儀,檢測器:Waters 2410示差折光檢測器(美國Waters公司);進樣量:50μL;柱溫:40℃;標準品:葡聚糖。

1.3.3 取代度的測定 準確稱量N-酰化低聚殼聚糖0.100 0 g置500 mL燒杯內,準確加入0.103 8 mol/L HCl標準溶液20.00 mL溶解樣品,再加入去離子水200 mL稀釋、混勻,用0.468 5 mol/L NaOH標準溶液返滴,測定電導率值,得電導率-氫氧化鈉體積關系圖,添加趨勢線,求其回歸方程,從而計算N-酰化低聚殼聚糖的取代度[9]。

1.4 對羥基自由基·OH的清除

用p H=7.40的0.05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液分別配制濃度為6.4×10-4mol/L的魯米諾溶液、0.012 mol/L H2O2和0.8 mg/mL亞鐵氰化鉀溶液。以緩沖液作為溶劑,配制成系列不同濃度的樣品溶液。用流動注射化學發光分析儀依次測定從稀到濃的樣品溶液,讀出峰面積。清除率= (A0-Ai)/A0×100%。式中A0為空白溶液峰面積,Ai為樣品溶液峰面積。經SOD,過氧化氫酶及甘露醇檢測,該體系產生的自由基羥基自由基· OH[10]。

1.5 對DPPH自由基的清除

在裝有2.0 mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液的比色管中,加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL,搖勻,33℃避光靜置30 min,在517 nm處測量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液,得吸光度A0,無水乙醇代替DPPH,得吸光度Aj。清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%[11]。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜

圖1是低聚殼聚糖及其N-酰化低聚殼聚糖的紅外光譜圖。NMCOS中1 640 cm-1為烯烴的VC=C振動峰;1 707 cm-1附近出現為不飽和羧基因共軛作用的C=O振動吸收峰;860 cm-1附近為C-H面外振動吸收峰,在殼聚糖未見此峰,這些峰證實了NMCOS中馬來酸基的存在[12]。在NPCOS中,1 640 cm-1為烯烴的VC=C振動峰;在750 cm-1附近的吸收峰為鄰二取代苯的δAr-H面外彎曲振動峰,這些峰證明了鄰苯二甲酸基的存在[13]。NMCOS和NPCOS在1 560 cm-1附近的仲酰胺的δNH振動峰在衍生物中明顯增大,同時在1 320 cm-1附近出現VC-N伸縮振動峰,并且在1 073 cm-1和1 023 cm-1處的C3仲羥基和C6伯羥基的C-O的伸縮振動吸收峰與殼聚糖相比沒有明顯變化,這均證明反應發生在氨基上[7]。凝膠色譜法測得NMCOS和NPCOS的相對分子質量大小分別為5 733和5 029。電導法測定其取代度均為0.25。

2.2 對羥基自由基·OH的清除能力的影響

羥基自由基·OH是一種化學性質很活潑的自由基,它易與生物大分子發生反應,如氨基酸、蛋白質和DNA,對機體危害極大,與衰老、腫瘤等密切相關[15]。

圖1 COS、NMCOS和NPCOS的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of COS、NMCOS and NPCOS

NMCOS和NPCOS對羥基自由基.OH的清除活性如圖2。隨著濃度的增加,NMCOS和NPCOS對羥基自由基·OH的清除能力逐漸增強。NPCOS清除羥基自由基·OH的IC50(清除率達到50%時所需自由基清除劑的濃度)為0.06 mmol/ L,而NMCOS沒有達到IC50。即取代度相同時, NPCOS對羥基自由基·OH的清除能力更強。

圖2 NMCOS和NPCOS對羥基自由基的清除Fig.2 Scavenging effects of NMCOSand NPCOS on hydroxyl radical

低聚殼聚糖及其衍生物中有大量的羥基和氨基,對羥基自由基·OH有如下作用[16]:(1)羥基的氫原子與羥基自由基·OH作用而達到清除目的; (2)氨基和羥基自由基·OH反應生成穩定的大分子自由基;(3)NH2先與溶液中的氫作用形成氨正離子NH3+,再與羥基自由基·OH作用形成穩定物質。對取代度相同的NMCOS和NPCOS,氨基與羥基數目相同。而清除羥基自由基·OH的活性不同,這與取代基團有關。NMCOS和NPCOS均是在低聚殼聚糖氨基上引入取代基,NMCOS的取代基是-COCH=CHCOO-,NPCOS的取代基是-COC6H4COO-,兩種基團都是吸電子基團,能降低低聚殼聚糖主鏈上的電子云密度,使分子內、分子間生成氫鍵的幾率降低,使氨基與羥基的活性增強,易與自由基反應。但是-COC6H4COO-的吸電子效應比-COCH=CHCOO-的吸電子效應強,故取代度相同時,NPCOS對羥基自由基·OH的清除能力比NMCOS強。

2.3 對DPPH的清除能力的影響

圖3是NMCOS和NPCOS對DPPH的清除曲線圖。NMCOS和NPCOS對DPPH的清除能力均隨著濃度的增加而增強。NMCOS和NPCOS的IC50分別是1.2 mmol/L和0.88 mmol/L。NPCOS清除DPPH的能力比NMCOS強。

穩定的DPPH體系是一種廣泛用于評價抗氧化劑自由基清除能力的方法。其主要原理是DPPH可以接受自由基清除劑提供的電子或氫從而形成穩定分子。在低聚殼聚糖及其衍生物中,主要是氨基和羥基提供氫與DPPH結合,從而達到清除DPPH的目的。在本體系中,NMCOS和NPCOS取代度相同,氨基和羥基數目相同,但-COC6H4COO-基團的吸電子作用比-COCH=CHCOO-基團的吸電子作用強,從而NPCOS的供氫能力比NMCOS強,故清除DPPH的能力強。

圖3 NMCOS和NPCOS對DPPH自由基的清除Fig.3 Scavenging effects of NMCOS and NPCOS on DPPHradical

3 結 語

作者對低聚殼聚糖進行酰化,制得取代度相同的NMCOS和NPCOS。并且考察了其對羥基自由基·OH和DPPH的清除能力。結果表明:取代度相同時,盡管氨基和羥基的數目相同,但是NMCOS和NPCOS對羥基自由基·OH和DPPH的清除效果不同。這說明不同的N-取代基對低聚殼聚糖清除自由基的影響不同。與NMCOS相比,NPCOS引進的-COC6H4COO-的吸電子能力比-COCH=CHCOO-較強,故其清除羥基自由基· OH和DPPH的能力較強。這一結果為低聚殼聚糖及其衍生物的的深入研究有指明了方向。

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(責任編輯:朱明)

The Radical Scavenging Effect of N-Acyl Chitosan Oligosaccharide

SUN Tao, YIN Xu-hong, XIE Jing, LI Li, LAI Ke-qiang, ZHOU Dong-xiang
(College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanhai 201306,China)

N-maleyl chitosan oligosaccharide(NMCOS)and N-phthaloyl chitosan oligosaccharide (NPCOS)with the same substituting degrees(0.25)were synthesized.The structure were characterized byFTIRspectra,themolecularweightwasmeasuredbyGelPermeation Chromatog-raphy(GPC).Their antioxidant activity were evaluated by the scavenging of hydroxyl radical(.OH)and 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical(DPPH).The results showed NPCOS have stronger hydroxyl and DPPH radical scavenging activity than that of NMCOS.The resultspresentedheredemonstratedthattheantioxidantactivityofN-acylChitosan Oligosaccharide with the same substituting degrees was determined by the substituting groups.

chitosan oligosaccharide,N-acyl,antioxidant activity,substituting degree

TS 202.3

:A

1673-1689(2010)03-0406-04

2009-06-15

上海市教育委員會科研項目(07zz134),上海市重點學科建設項目專項基金(T1102),上海市生物醫藥和農業科技領域重點科技項目(08391911500),2009年上海市優秀學科帶頭人計劃(09XD1402000)。

孫濤(1970-),女,黑龍江依蘭人,理學博士,副教授,主要從事多糖的改性及生物功能的開發。Email:taosun@shou.edu.cn