新鮮哈密瓜汁中可培養細菌的分離鑒定及系統發育分析

姜海榮, 倪永清, 宋麗軍, 尹琳琳, 江英, 陳計巒

(新疆石河子大學食品學院,新疆石河子 832003)

新鮮哈密瓜汁中可培養細菌的分離鑒定及系統發育分析

姜海榮, 倪永清, 宋麗軍, 尹琳琳, 江英, 陳計巒＊

(新疆石河子大學食品學院,新疆石河子 832003)

采用稀釋平板法從新鮮哈密瓜汁中分離出48株可培養細菌,通過傳統的形態特征鑒定,將其歸為10個類群。利用細菌通用引物PCR擴增10個類群代表菌株的16S rRNA基因,并進行序列測定。將獲得的序列通過Blast在GenBank數據庫中搜索相關菌株的同源性序列,采用Clustal1.81軟件比對,用Mega 4.1軟件構建系統發育樹。系統發育分析結合表型特征研究表明,新鮮哈密瓜汁中可培養細菌以芽孢桿菌屬為優勢微生物類群,主要為枯草芽孢桿菌B acillus subtilis,其次為地衣芽孢桿菌B acillus lichenif ormis、蘇云金芽孢桿菌B acillus mojavensis。此外還有銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋蔥伯克霍爾德氏菌B urkholderia cepaciastrain、鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii,以及腸球菌屬Enterococcussp、克雷伯氏菌屬Klebsiellasp的菌株。

新鮮哈密瓜汁;可培養細菌;16S rDNA;序列分析;系統發育分析

新疆哈密瓜風味獨特、富含多種營養物質,其果汁為金黃色,處于均勻的混合狀態,是一種很有市場潛力的果汁。但哈密瓜是熱敏性瓜果,采用傳統的高溫殺菌,將使哈密瓜汁產生不良的蒸煮味,且失去大量營養物質,因此對于熱敏性的果蔬汁多采用非熱力殺菌模式。研究表明[1],引起果汁腐敗變質的因素很多,如微生物、酶類等,但是引起新鮮果汁腐敗變質的主要因素是微生物污染。

為了選擇合適的殺菌方式,更有效地控制哈密瓜汁中微生物,就必須首先了解哈密瓜汁中的常見微生物的種類、特性和數量分布狀況,然后才能有針對性地選擇適宜的殺菌方法和殺菌工藝。因此對新鮮哈密瓜汁中的微生物種類進行分離和鑒定,對如何控制新鮮哈密瓜汁中微生物具有非常重要的意義。

果汁中的微生物菌群相對復雜,按照傳統的以形態學和生理生化指標為基礎的細菌檢測和分類方法較為繁瑣。目前隨著分子生物學的發展,采用16S rRNA基因鑒定未知菌更加方便、快捷、高效。因此16S rRNA已經成為細菌系統分類研究中最常用也是最有效的分子指標,被廣泛地應用于各種微生物的遺傳特性和分子差異的研究[2]。作者在研究新鮮哈密瓜汁中的可培養細菌基本生長特性的基礎上,采用細菌通用引物對分離菌株的16S rRNA基因進行擴增和快速鑒定,以確定哈密瓜汁中微生物類群的多樣性,為哈密瓜汁的有效殺菌和貯藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及儀器設備

1.1.1 材料 新疆哈密瓜,品種為伽師瓜86-1,產于新疆喀什市,其新鮮哈密瓜汁p H值為6.55。

1.1.2 菌種 分離自新鮮哈密瓜汁中的可培養細菌。

1.1.3 儀器設備 SW-CJ-100型超凈工作臺,蘇凈集團安泰公司制造;DNP-9272型電熱恒溫培養箱:上海精宏實驗設備有限公司制造;SPX-250B-2型生化培養箱:上海博遠實業有限公司制造;TC-512型PCR儀:Barloworld公司制造;Gel DoxTMXR 170-8170型凝膠成像系統:Blo-RAD公司制造。

1.2 培養基

1.2.1 LB固體培養基: 胰蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,瓊脂17 g,調p H 7.0,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 營養肉湯培養基(NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂17 g,調p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 營養瓊脂肉湯培養基(NB) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,調p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.3 細菌的分離、純化及保存

100個哈密瓜隨機分為5組,每組隨機選取一個,瓜體表面經過酒精消毒,去皮去瓤,在無菌超凈臺將哈密瓜切成1 cm小塊放入無菌培養皿,再用無菌玻板搗碎,靜置10 min,吸取1 mL新鮮瓜汁接入9 mL無菌生理鹽水,即得10-1濃度菌懸液,依次類推,分別制取10-2、10-3濃度菌懸液。稀釋平板法分離哈密瓜汁中可培養細菌。

取菌落數在30～300個之間而且菌落之間分離生長較好的平皿,無菌操作挑選不同形態和顏色的菌落,在NA培養基上進行平板劃線分離,將此平皿置37℃恒溫箱內培養2～4 d,挑取的菌落經3～5次的平板劃線分離后,如果菌落形態、顏色較一致,則進行革蘭氏染色后鏡檢,經過分離得到的單菌落進行涂片和簡單結晶紫染色,在1 000倍光學顯微鏡下觀察觀察其形態和純度[3],不純的菌落用平板稀釋法進行純化,分離純化后在4～6℃下保存。另一份純化后的單菌落接入營養肉湯培養培養基,37℃搖床培養后加入體積分數15%的甘油,于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.4 革蘭氏染色和鏡檢

取菌種培養物常規涂片,用結晶紫進行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇脫色,最后用番紅復染。在顯微鏡下觀察個體形態特征,如果發現還有雜菌,則繼續進行平板劃線分離,直至鏡檢個體形態特征一致。鏡檢中細胞保留藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌,細胞為紅色的細菌為革蘭氏陰性。

1.5 芽孢檢測

分離出的菌株分別編號為s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2,接種到NA平板上,30℃培養3～7 d,顯微鏡觀察是否有芽孢形成。

1.6 生長溫度范圍和pH值范圍的測定

分離的菌株編號為s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2。

1.6.1 生長溫度范圍 為準確測定溫度范圍[4],采用下面兩個步驟:

1)粗測:首先將以上編號的菌懸液以涂布法涂布在p H為7.0的NA培養基平板上,將平板分別在溫度為20、30、40、50、60、70℃條件下恒溫培養48 h后觀察菌落生成情況,初步確定各菌生長溫度范圍。

2)精測:確定大致范圍,再將以上編號的菌懸液以涂布法涂布在p H為7.2的NA培養基平板上,使其溫度值在粗測的范圍內精確到0.1,將平板分別在不同的溫度下恒溫培養48 h,觀察菌落生成情況,最終確定各菌生長溫度范圍。

1.6.2 不同菌生長p H值范圍的確定

1)粗測:分別采用1%的稀硫酸,1%的氫氧化鈉溶液來調整NA培養基的p H值,使其p H值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,將不同編號菌懸液以涂布法分別涂布在不同p H值的NA培養基上,37℃下培養48 h后觀察菌落生成情況,初步確定耐熱菌的生長p H值范圍。

2)精測:經初步確定,將耐熱菌菌懸液以涂布法分別涂布在不同p H值的NA培養基上,使其p H值在粗測的范圍內精確到0.1,37℃下培養48 h后觀察菌落生成情況,最終確定不同菌的生長p H值范圍。

1.7 細菌菌株的16S rDNA鑒定

1.7.1 細菌培養及染色體DNA制備 接種單菌落于5 mL LB培養基中,37℃培養過夜。然后取1 mL培養液接入100 mL LB培養基中,37℃、220 r/min培養24 h,5 000 r/min離心15 min,棄上清液,加入無菌水離心洗滌,棄上清液,再加入10 mL TE離心洗滌,棄上清液,加入10 mL TE溶解菌體,混勻于-20℃保存備用。

取0.5 mL菌懸液加入30μL SDS混勻,加入10μL 20 mg/mL蛋白酶K,10μL溶菌酶,37℃混勻溫育1 h。加入100μL、5 mol/L NaCl,再加入80μL CTAB/NaCl溶液混勻,65℃溫育10 min,加入等體積V酚∶V氯仿∶V異戊醇為25∶24∶1,混勻于12 000 r/min離心5 min,保留上清液,上清液中加入等體積V酚∶V氯仿∶V異戊醇為25∶24∶1混勻, 12 000 r/min離心5 min,保留上清液,上清液中加入氯仿/異戊醇,12 000 r/min離心5 min,保留上清液。上清液中加入無水乙醇和醋酸鈉,輕輕混合直到DNA沉淀下來,冷藏過夜,12 000 r/min離心5 min,收集沉淀,用70%乙醇離心洗滌沉淀,用1 mL TE溶解DNA,加入20μg/mL RnaseA于4℃保存。

DNA電泳檢測:用1 g/dL瓊脂糖凝膠(含核酸染液),每孔點樣6μL(5μL樣品+1μL loading butter),電泳為100 V/h。

1.7.2 16S rDNA基因的PCR擴增和產物純化目前根據大腸桿菌的基因組序列設計出了多對用于16S rDNA序列擴增的引物。作者選擇引物為27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3對應于E.coli16S rDNA的8～27位和1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3,對應于E.coli16S rDNA的1 525～1 542位進行擴增,該對引物能夠擴增出近乎全長的16S rDNA序列,長度約為1 500 bp。

50μL16S rDNA-PCR的反應體系:16S rDNAPCR的反應體系:10×的Taq Buffer 5μL,2.5 mmol/L dNTP 4μL,2.5 U Taq酶0.2μL,0.4 μmol/L的引物1μL,模板約500 ng/μL,2 mmol/L MgCl24μL,使用超純水將反應體系補至50μL。

熱循環參數設置為:95℃預變性4 min,94℃變性1 min,55℃復性1 min,72℃延伸2 min,30個循環;72℃延伸7 min。取3～5μL擴增產物于1 g/dL的瓊脂糖凝膠上電泳,利用凝膠成像系統成像。

1.7.3 PCR產物的測序及結果分析 PCR產物通過切膠純化,樣品送至上海生工公司雙向測序,將拼接后的測序結果輸入http://www.ncbi.nlm. nih.gov/,通過互聯網,將測得的基因序列,通過Blast程序與GenBank數據庫中相似性較高的相關菌株的16S rRNA基因序列進行同源性分析。

序列的比較及系統發育分析采用Clustalx1.81軟件與GenBank基因序列作最大同源性比較分析,并利用Mega 4.1軟件以N-J法(neighbor-joining)作系統樹,并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 16S的rDNA-PCR產物純化電泳檢測

PCR產物純化,經電泳后利用小源凝膠成像系統成像,見圖1。與Maker條帶比較,可知目標擴增產物的片段長度大約為1 500 bp。圖1標號為1～10,分別為s-5-2、B-1、s-4、s-5-1、A-1、AAM-1、AAM-2、S-2、s-3、B-2的16S rDNA-PCR產物純化電泳圖。

圖1 不同分離自新鮮哈密瓜汁中菌株16SrDNA-PCR產物純化電泳圖譜Fig.1 Diagram of Agarose gel electrophoresis of strains isolated from freah H ami-melon juice by 16S rDNA-PCR

2.2 形態特征、基本生長特征及序列分析

不同編號菌株的形態特征、基本生長特征及序列分析結果見表1。

根據與Genebank中已有的核酸序列比較結果,除s-3和B-2菌株外,其余8株菌與數據庫中同一種的細菌同源性均大于99%。一般認為,16S rDNA序列同源性小于98%,可以認為屬于不同的種,同源性小于93%～95%,可以認為屬于不同屬[5]。因此s-5-2、s-4、B-1可以確定為枯草芽孢桿菌B acillus subtilis,AAM-1可以確定為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosastrain,AAM-2可以確定為洋蔥伯克霍爾德氏力B urkholderia cepacia,S-2可以確定為鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumanniistrain,A-1可以確定為蘇云氏芽孢桿菌B acillus mojavensisstrain,s-5-1可以確定為地衣芽孢桿菌B acillus lichenif ormisstrain,s-3和B-2分別可以確定為腸球菌屬Enterococcus和克雷伯氏菌屬Klebsiella。其中s-3與糞腸球菌同源性高達97%,有可能與其是一個種。B-2可能屬于克雷伯氏菌屬的某個新種。

2.3 16S rDNA序列的系統發育分析

將各代表菌株和應用Blast檢索到的與之有較高同源性菌株的16S rDNA序列利用Clustalx1.81軟件與GenBank基因序列作最大同源性比較分析,并利用Mega 4.1軟件以N-J法(neighbor-joining)作系統樹,并構建系統發育樹,確定菌株的分類地位。在圖2中,A-1、s-5-1、s-5-2、B-1、s-4親緣關系非常近,與s-3較近,基本屬于同一屬的范圍內,而與AAM-1,AAM-2,S-2,B-2親緣關系非常遠。

圖2 新鮮哈密瓜汁中分離菌株序列系統發育分析(NJ)Fig.2 Neighbor-joing tree constructed showing the phylogenetic relationships among 16SrRNA gene sequences of isolated from H ami-melon juice.The scale bar represent 0.05 substitution

3 討 論

基于當今分子生物學技術迅速的發展,越來越多的研究者開始使用16S rDNA序列分析方法[6]。作者采用傳統方法將所有分離到的菌株作初步的形態觀察和生理學檢測,將分離到的48株菌分為10個類群,應用16S rDNA作為分子指標,擴增出未知菌的16S rDNA,純化測序,測序結果在Genbank中用Blast比對分析發現,從哈密瓜汁分離的不同菌株,大部分與已知菌都有很高的同源性,且能達到鑒定種的水平,很少可能有新種。

作者從新鮮哈密瓜汁中分離的48株可培養細菌,其中分離芽胞菌比例最大,占分離菌株的60%,為哈密瓜汁中主要的菌群。芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌,在缺氧或不利條件下形成芽胞,是食品中常見的一種污染菌,在傳統的發酵制品中污染幾率更大[7]。一般而言,耐熱的細菌同樣耐壓,枯草芽胞桿菌比嗜熱脂肪芽胞桿菌(B acillus stearothemophilus)更耐壓[8-9]。陳世瓊等[10]人對蘋果汁中酸耐熱菌的分離鑒定為蘋果汁的非熱力殺菌技術提供了研究方向。

由于芽胞菌為哈密瓜汁中主要的菌群,在選擇哈密瓜汁殺菌方式時,應考慮該菌群的殺滅程度對果汁品質本身可能造成的影響,因此該研究可為后續研究超高壓處理哈密瓜汁的殺菌工藝提供更為可靠的依據。

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(責任編輯:李春麗)

Identification and Phylogenesis Analysis of Cultivable Microorganism Isolated from Fresh Hami-Melon Juice

J IANG Hai-rong, NI Yong-qing, SONG Li-jun, YIN Lin-lin,
J IANG Ying, CHEN Ji-luan＊
(College of Food Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Forty-eight strains were isolated from the fresh hami melon juice using the dilution plate method.Those isolated strains divided into ten groups according to the morphological features. Then the 16S rDNA sequences were performed by employing the universal prime bacterial for polymerase chain reaction(PCR)amplification.The alignment search was performed with BLAST and GenBank databases,then compared this sequences using the software of Clastal1. 81,the phylogenetic tree was built using Mega 4.1 software.From the phylogenetic tree,it could be concluded thatB acillus subtilisis the main cultivated bacteria in the fresh hami melon juice and the following isB acillus lichenif ormis,B acillus mojavensis,Pseudomonas aeruginosastrain RE7,B urkholderia cepaciastrain ATCC 21809,Acinetobacter baumannii,andEnterococcussp,Klebsiellasp.

fresh hami melon juice,cultivate bacteria,16S rDNA,sequence analysis,phylogenetic

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0426-06

2009-09-07

教育部重點項目(207137);兵團博士基金項目(2007jc11);國際科技合作項目(2009DFA32160)。

＊通信作者:陳計巒(1973-),女,新疆石河子人,工學博士,副教授,碩士生導師,主要從事農產品加工與貯藏方面的研究。Email:chenjiluan@163.com。