野生型p53誘導基因1研究進展*

鄒瀛波綜述,郭 偉,蔣耀光審校

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所全軍胸外科中心,重慶 400042)

p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因。過去20多年來,人們對p53基因的認識經歷了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的3個認識轉變,現已認識到,引起腫瘤形成或細胞轉化的突變型p53蛋白是野生型p53基因突變的產物,是一種腫瘤促進因子,它可以抑制正常p53蛋白的功能,而野生型p53基因是一種抑癌基因,它的失活對腫瘤形成起重要作用[1]。

目前研究已經證實,p53可以誘導多種基因的表達,然而到目前為止,研究者尚未發現僅影響p53依賴凋亡途徑的單一基因。在野生型p53誘導基因1(wild-type p53-induced gene 1,WIG-1)被發現之前,研究者猜測p53誘導的凋亡可能與一種還未被命名的p53相關基因的表達有關,同樣,p53在諸如分化和發育過程中的功能可能依賴于這一特殊基因的調節。之后的研究結果表明WIG-1有可能是影響p53依賴凋亡途徑的調節基因[2],因此,對于WIG-1基因的進一步研究,將有可能為闡明p53誘導生理途徑的分子機制提供有益的思路和見解。

1 WIG-1的發現

1995年,Leone等[3]通過對J3D小鼠T淋巴瘤細胞周期和凋亡進行研究后發現,在溫度敏感的結構中表達的野生型p53(溫度敏感p53基因)能夠誘導p53陰性的J3D小鼠T淋巴瘤細胞出現G1期停滯和細胞凋亡。p53通過一段特殊序列與DNA結合,并激活帶有特殊p53DNA基因的轉錄子,這種特殊的p53DNA和它們的啟動子結合在一起。p53的這種由特殊序列激活的功能對于p53介導的體外生長抑制作用是至關重要的[4]。這些發現表明,特殊的DNA結合序列及其活性對于p53的腫瘤抑制起到了決定性作用。對結果進行進一步分析后發現了一個新的p53誘導的基因——WIG-1,其7.6 kb的和2.2 kb的轉錄子在溫度敏感的p53轉染的J3D細胞中的表達是上調的。細胞經γ射線照射后過表達的NIH3T3和p21可以誘導WIG-1的轉錄。全身γ射線照射可以誘導鼠的腦、睪丸、腎、脾和肺組織 WIG-1表達水平上調,而在未接受γ射線照射的腦、睪丸和腎組織中也可檢測到WIG-1的基礎表達[4]。進一步的研究表明,WIG-1是一種由p53基因誘導表達的鋅指蛋白,在其分子中含有3個鋅指結構,WIG-1蛋白中的3個鋅指結構能夠與特定蛋白、RNA及DNA結合,人類WIG-1與包括小干擾RNA和microRNA在內的不同類型的雙鏈RNA結合后,能夠發揮抑制細胞生長的作用[5]。

另外,有研究者發現,用阿霉素等抗腫瘤藥物處理攜帶野生型p53基因的B淋巴細胞,在p53過表達的同時可以檢測到WIG-1的表達水平上調[6]。結果進一步表明WIG-1的表達可以由p53誘導,因此,WIG-1是一個p53誘導基因。

目前已發現的WIG-1同源體有:嚙齒類動物細胞中的PAG608(p53-activated gene 608,p53激活基因608)和哺乳動物細胞中的ZMA T-3(zinc finger,matrin type 3,鋅指基質蛋白3)。PAG608在嚙齒類動物所有組織中都可以檢測到其表達,而在胰腺、腦和肺組織中的表達水平最高[7]。

2 WIG-1的結構與定位

WIG-1定位于細胞核,編碼包含3個Cys2his2型鋅指的鋅指蛋白,WIG-1的鋅指是由56～75個氨基酸連接而成的,定位于人類3號染色體長臂的26.3區(3q26.3),見圖 1[8]。

圖1 WIG-1定位圖

WIG-1在轉錄水平的選擇性拼接可以產生兩種轉錄變異體(轉錄變異體1及轉錄變異體2),兩種變異體序列中僅僅有一個氨基酸不同。相對于轉錄變異體1,轉錄變異體2在5′端的非編碼區缺少一個片段,在編碼區存在一個替代剪接位點,其開放讀碼框沒有GCA密碼子,編碼序列含有288個氨基酸。WIG-1在生物進化過程中高度保守,其鋅指蛋白氨基酸序列及結構在人類與魚類中幾乎完全一致[9]。這些鋅指區域類似于早先發現的雙鏈RNA結合蛋白,dsRBP-ZFa和JAZ。小鼠WIG-1與JAZ和dsRBP-ZFa一樣是一個核蛋白,與其具有結構相似性。這種Cys2his2型鋅指蛋白代表了一大類具有識別特殊DNA序列的蛋白,然而,這種蛋白也與單鏈RNA、DNARNA雜合體,dsDNA(雙鏈DNA)和其他蛋白相互作用。同JAZ一樣,WIG-1也定位于核內,這與小鼠WIG-1蛋白和已觀察到的人與大鼠WIG-1蛋白在核內與核仁內的定位是一致的。由于WIG-1與dsRNA(雙鏈RNA)而不是 ssRNA(單鏈RNA)相作用,所以WIG-1代表了一類與以往發現所不同的p53誘導基因[10]。

3 WIG-1的功能

3.1 與dsRNA的結合活性 目前研究己經證實小鼠WIG-1通過其第1個鋅指區域與dsRNA相結合。異常表達FLAG標記的鼠WIG-1蛋白定位于細胞核,在某些細胞中定位于核仁,而GFP標記的鼠WIG-1則主要定位于核仁,WIG-1優先與dsRNA結合,而不是ssRNA或者dsDNA,WIG-1的第1個鋅指區域對于dsRNA結合功能至關重要,而鋅指2和3則不是必需的。在哺乳動物細胞中表達的WIG-1蛋白顯示出與

dsRNA的高度親和性,而在所有p53誘導表達的基因中,類似WIG-1的dsRNA結合活性是首次發現。這表明 WIG-1與JAZ和dsRBP-ZFa等dsRNA結合蛋白具有結構相似性,也進一步提示dsRNA結合在p53依賴的生理反應中可能具有重要作用[11]。

WIG-1由野生型p53誘導上調表達,是p53介導的轉錄活化的一個直接靶點。已有研究證實其是一個由p53直接轉錄的基因,并且是一個善意的目的基因,WIG-1的3個鋅指區域包含在其第2、第4外顯子核苷酸序列中,其與p53結合的同一序列相關。其中的2個鋅指區域BM2和BM3,與重組p53共同形成DNA蛋白雜合體[12]。

WIG-1的第1個鋅指區域對于在體外或活體細胞中結合dsRNA至關重要。野生型 WIG-1和ZF1、ZF2點突變型WIG-1都具有抑制細胞克隆形成能力的作用,證明這兩個ZF突變對WIG-1抑制細胞增殖功能未造成重要的影響,但進一步的研究發現突變型WIG-1的復制效率要低于野生型WIG-1[11]。

有研究發現,人類WIG-1也結合dsRNA,WIG-1與活細胞中內生dsRNA的互相作用表明這種相互作用是與生理性相關的,但是它的確切機制和作用目前仍不清楚。WIG-1通過其N末端的鋅指區域與50～100 bp長的dsRNA結合,WIG-1結合的21 bp的dsRNA與siRNA具有結構相似性。這些結構相似性,包括它們獨特的鋅指分布規律,表明它們的功能是相近的[5]。

3.2 抑制細胞增殖 WIG-1分子中鋅指區域的發現,提示其可能是一種核苷酸結合蛋白,但目前對其在p53依賴的生理反應中所起的作用和機制仍知之甚少。小鼠與大鼠PAG608和人的WIG-1蛋白具有高度同源性,分別有97.9%和87%的氨基酸序列相同[13]。當大鼠PAG608在人類腫瘤細胞中過表達時,有較弱的促進凋亡活性。這也提示WIG-1可能具有啟動細胞凋亡的功能。Issei等[14]進行的克隆實驗結果表明,人WIG-1能夠顯著抑制食管鱗癌細胞增殖,其抑制率可達25%～30%。

有研究者認為WIG-1可能與miRNA(microRNA)調節的細胞生長和生存有關,并且具有啟動p53誘導的細胞生長停滯和(或)誘導凋亡的作用,WIG-1與特殊的miRNA相結合能夠增加由miRNA和它的mRNA形成的有缺陷的小二重區域的穩定性[11]。

在WIG-1啟動子中,幾個p53結合序列的存在反映了由p53和其家族成員p63、p73介導的是一個相當復雜的轉錄調節過程。p63、p73和 p53一樣,能夠結合相同的序列并上調目前已知的幾種p53目的基因。p53以SP1或SP1相關蛋白作為一個共同因子,目的是達到p21和Bax啟動子的最大活化。在WIG-1啟動子中富含GC的區域也可以提供SP1結合位點[12],這與p53作用是非常類似的,但WIG-1是否能與p63及p73相結合進而發揮其功能尚有待進一步研究。

WIG-1的mRNA在腦與睪丸組織中表達水平相似,而在肺、腎、脾臟經過全身γ射線照射后表達上調,其中原因有可能是γ射線照射能夠激活上述組織中p53的表達。WIG-1啟動子有兩個功能性的p53結合位點,使WIG-1可能具有p53依賴性轉錄調控功能,這也證明了WIG-1是一種善意的p53目的基因[12]。WIG-1與核糖體RNA相結合能干擾核糖體的合成,從而導致蛋白復制的抑制以及生長抑制,并最終導致細胞死亡,因此可能起到抑制腫瘤細胞增殖的作用[12]。

4 Cys2his2型鋅指蛋白的功能

鋅指蛋白是指含有通過結合Zn2+穩定的短的可以自我折疊形成“手指”結構的一類蛋白質,由于其自身的結構特點,可以選擇性地結合特異的靶結構,使鋅指蛋白在基因的表達調控、細胞分化、胚胎發育等生命過程中發揮重要作用。

根據鋅指結構序列和功能的不同將其分為9大類,TFⅢA鋅指(Cys2his2),類固醇-甲狀腺素受體(Cys8),GAL4鋅指(Cys6),環狀鋅指(Cys3HisCys4),逆轉錄病毒粒子(Cys2hisCys),LIM鋅指(Cys2hisCys5),GATA-1鋅指(Cys4),Nup475鋅指(Cys3His),requium 鋅指(Cys4HisCys3)。根據鋅指蛋白保守結構域的差異,又可以將其分為C2h2型(Krüppel相關型)、C4型和C6型等 3個類群。根據鋅指的空間結構來綜合分類,認為每一種鋅指都可以在8組不同的折疊群中找到相應的歸類,其分類為:類C2h2鋅指、高音譜號鋅指、鋼卷尺狀鋅指、箝口膨出狀鋅指、類Zn2PCys6鋅指、類 TAZ2鋅指、鋅結合短環鋅指、金屬硫蛋白鋅指[15]。

Cys2his2型鋅指蛋白的功能主要為兩個方面:調控基因轉錄(即與核酸的相互作用)以及鋅指蛋白之間的相互作用。Cys2his2型鋅指蛋白能特異性地識別DNA,主要是由于其DNA結合域具有與DNA雙螺旋互補的特殊表面結構,依靠其指型空間結構伸入到DNA雙螺旋的大溝內,通過α螺旋與DNA堿基發生特異性接觸[16]。另外,Cys2his2型鋅指不僅能與DNA發生相互作用,也可以識別 RNA,如TFⅢA既可以與5SrDNA結合,也可以與該基因的轉錄產物5SrRNA結合形成7S RNP復合物[16]。Cys2his2型鋅指蛋白還能與DNARNA雜交雙鏈分子的特異性結合。轉錄激活因子 SP1與WIG-1一樣同屬Cys2his2型鋅指蛋白,SP1主要通過調控富含GC啟動子的基因表達,參與調節細胞功能,如細胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成。近年來的研究表明鋅指之間可以互相作用,鋅指與鋅指或鋅指蛋白與鋅指蛋白通過相互作用,能夠識別更多不同的DNA或阻止鋅指同DNA結合,進一步發揮調控基因轉錄的作用[17]。

5 小結與展望

以往研究證實,3q25～27區在包括肺鱗狀細胞癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、卵巢癌以及前列腺癌等多種人類惡性腫瘤中均存在異常擴增[5],眾多研究者相信在該區域極有可能篩選到可用于腫瘤基因診斷和治療的候選分子。WIG-1基因由于具有對細胞生長周期和凋亡的調控作用,加之其定位在3q25～27區,使得研究者相信WIG-1有可能是潛在的候選腫瘤標志物和基因治療靶點。由于研究時間尚短,WIG-1在惡性腫瘤發生發展中所起的作用及其分子機制還有待進一步研究。隨著對WIG-1功能及其機制了解的不斷深入,有望為p53介導的腫瘤抑制途徑研究領域帶來新的觀點和突破。

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