甲狀腺乳頭狀癌中DNA修復(fù)基因hMLH1的甲基化與BRAF突變的關(guān)系

寶 榮,邵 華,成建新,王 佾

(1.重慶市第九人民醫(yī)院病理科 400700;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普外三科,沈陽110004;3.山東省濱州市人民醫(yī)院病理科 256610)

上皮細(xì)胞起源的甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,也是近年來發(fā)病率增加最快的惡性腫瘤之一[1]。組織學(xué)上,最常見的甲狀腺癌是乳頭狀甲狀腺癌(PTC),約占甲狀腺癌的80%。已有研究表明PTC中存在基因的甲基化現(xiàn)象,與PTC腫瘤腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、多病灶等惡性病理特征關(guān)系密切,并且與 PTC中另一個(gè)重要的遺傳事件——T1799A BRAF基因突變相關(guān)[2-4]。hMLH1是重要的DNA修復(fù)基因,在維持基因組穩(wěn)定上發(fā)揮著重要作用[5]。本研究擬探討PTC中是否存在hMLH1基因的甲基化,以及甲基化是否與臨床病理特征相關(guān)、是否與BRAF基因突變相關(guān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 研究病例來自2005～2006年在濱州人民醫(yī)院行甲狀腺全切術(shù)的PTC患者(60例),其中男12例,女48例,年齡26～66歲,平均年齡44歲。獲取腫瘤石蠟切片和臨床病理學(xué)資料,包括腫瘤的甲狀腺外侵襲情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。另收集20例癌對(duì)側(cè)甲狀腺正常組織石蠟切片。

1.2 提取DNA 從石蠟組織切片中提取DNA。首先在室溫下用二甲苯處理切片8 h以去除石蠟,然后在48℃下用1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.5 mg/mL蛋白酶K消化48 h,其間為加快消化過程分2～3次加入 20%SDS-蛋白酶 K 3～5 μ L。隨后用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿提取術(shù)和乙醇沉淀法將DNA從消化后的組織中進(jìn)行分離。

1.3 DNA的重亞硫酸鹽處理 對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理使胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。首先將2 μ g DNA 和5 μ g鮭魚精子DNA與0.3 M氫氧化鈉在50℃進(jìn)行孵育,接著加入500 μ L含有3 M亞硫酸氫鈉和10 mM對(duì)苯二酚的新鮮混合液,在70℃孵育2～3 h。使用親和層析柱對(duì)DNA標(biāo)本進(jìn)行提純(Wizard?DNA Clean-Up System,Promega,美國)。提純后的標(biāo)本經(jīng)0.3 M氫氧化鈉在室溫下處理10 min,用乙醇析出。將重亞硫酸鹽處理過的DNA干燥后再次混懸于30 μ L水溶液中以備進(jìn)行基因甲基化分析。

表1 本研究中用到的MSP引物序列和PCR退火溫度

表2 hMLH1基因甲基化與腫瘤臨床病理特征及BRAF突變的關(guān)系〔n(%)〕

1.4 T1799A BRAF突變分析 BRAF基因第15外顯子的T1799A突變是PTC中占絕大比例的BRAF突變。本研究中,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)標(biāo)本DNA BRAF基因的第15外顯子進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列:5′-TCA TAA TGC TTG CTC TGA T AG GA-3′(正 向)和 5′-GGC CAA AAA TT T AAT CAG TGG A-3′(反向)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過Big Dye循環(huán)反應(yīng)后進(jìn)行直接測(cè)序(ABI PRISM 3730基因測(cè)序儀,加拿大)。

1.5 甲基化特異性PCR(MSP) MSP反應(yīng)在20 μ L含有重亞硫酸鹽處理的DNA的反應(yīng)混合液中進(jìn)行。反應(yīng)混合液包括約50 ng重亞硫酸鹽處理的DNA,16.6 mM硫酸銨,67 mM Tris(pH 8.8),2 mM MgCl2,每種三磷酸脫氧核苷酸200 μ M(dATP,dCTP,dGTP和dT TP),200 nM正向引物和反向引物以及0.5單位Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司,美國)。MSP引物序列和PCR退火溫度(表 1)。MSP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用溴化乙錠進(jìn)行顯色。以經(jīng)體外甲基化酶處理的DNA樣品作為MSP的陽性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻率和百分?jǐn)?shù)表示,計(jì)量資料應(yīng)用表示。計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)應(yīng)用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)應(yīng)用t檢驗(yàn)。P值采用雙側(cè)檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本中DNA修復(fù)基因hM LH1甲基化狀況 60例PTC標(biāo)本中,hMLH1基因甲基化的發(fā)生率為23%(14/60)(圖1)。hM LH1基因的甲基化與某些臨床病理特征有相關(guān)的趨勢(shì),但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。20例正常甲狀腺組織中,未檢出hMLH1基因甲基化。

2.2 標(biāo)本中 T1799A BRAF突變狀況 60例PTC標(biāo)本中,T1799A BRAF突變率為65%(39/60)(封 3圖2)。突變與臨床病理特征亦未見顯著關(guān)聯(lián)(表2)。20例正常甲狀腺組織中,未檢出BRAF基因突變。

圖1 MSP結(jié)果示意圖

2.3 基因甲基化與 T1799A BRAF突變的關(guān)系 攜帶T1799A BRAF突變的PTC病例中,33%(13/39)發(fā)生了DNA修復(fù)基因hMLH1甲基化;而攜帶野生型BRAF基因的PTC病例僅為 5%(1/21),二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。

3 討 論

DNA甲基化是重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制,尤其在胚胎發(fā)育時(shí)更是如此。生理情況下,甲基化存在于失活的X染色體和印記基因;正常表達(dá)的基因如管家基因,則不發(fā)生甲基化。腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤細(xì)胞基因組局部區(qū)域基因存在高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤的基因和血管形成抑制基因等,導(dǎo)致相應(yīng)的基因沉默而致表達(dá)減少或完全喪失。與突變等基因?qū)W改變比較,DNA甲基化常常是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要的早期事件[6]。

本研究中探討的基因——hM LH1是與DNA修復(fù)密切相關(guān)的基因,它位于染色體3p21.3區(qū),參與了錯(cuò)配修復(fù)過程[5]。hM LH1基因甲基化或突變是結(jié)腸癌的常見遺傳事件[7-9]。在甲狀腺癌中,hM LH1基因的甲基化狀況研究甚少。本研究結(jié)果表明,hM LH1基因的甲基化在PTC中并不常見。研究中發(fā)現(xiàn)的甲基化病例,其腫瘤有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期較晚的趨勢(shì),盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但仍提示甲基化可能參與了PTC的發(fā)生和發(fā)展。制研究歷程中的突破性事件。這一突變導(dǎo)致BRAF蛋白第600位的氨基酸由 V變?yōu)镋,造成 Ras→ Raf→MEK→ERK/MAP激酶通路(MAP激酶通路)的異常持續(xù)激活,促進(jìn)PTC發(fā)生、進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移。BRAF基因突變發(fā)生于約45%的PTC和25%的甲狀腺未分化癌(ATC)患者中,大樣本的研究顯示該突變與腫瘤的高惡性度相關(guān)[10]。本研究中BRAF突變雖然與腫瘤的腺外侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),考慮是由于研究納入的樣本量較小。對(duì)BRAF基因突變導(dǎo)致甲狀腺癌惡性程度增高的分子機(jī)制還沒有令人信服的解釋。最近的一些研究觀察到甲狀腺癌中BRAF基因T1799A突變與多種基因高甲基化的存在相關(guān),如 SLC5A8、TIMP3、DAPK 和 RARβ2[11]。本研究也提示DNA修復(fù)基因的甲基化與BRAF基因突變有關(guān)。因?yàn)檫@些基因發(fā)生甲基化也預(yù)示腫瘤具有更多的惡性病理特征,推測(cè)BRAF基因突變可能是通過基因的甲基化改變導(dǎo)致腫瘤具有更高的侵襲性,更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

總之,本研究結(jié)果顯示,PTC中DNA修復(fù)基因hMLH1甲基化較T1799A BRAF突變少見;甲基化的發(fā)生與腫瘤的臨床病理特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但在攜帶T1799A BRAF突變的PTC病例中更為常見。

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